在肿瘤治疗中,单一疗法往往具有局限性,治疗疗效与结果也不尽人意。将化疗、放疗、手术、生物治疗等疗法联合使用,可起到协同抗癌效果,延缓肿瘤生长,增强抗癌作用的同时降低毒副作用。其中,化疗和免疫疗法的联合是一种常见联合治疗策略,二者可以起到相互促进的协同抗癌作用。然而,小分子化疗药物和免疫治疗的基因药物在复杂的生理环境内面临多重屏障,极易被水解或清除,很难靶向到达肿瘤部位,且多数化疗药物具有较大的毒副作用。因此,将智能纳米递送系统用于联合治疗增强疗效与抗肿瘤作用具有重要的研究意义和临床应用价值。纳米颗粒进入人体后,会面临多重生物屏障,如何针对不同阶段生理障碍的特性设计出高效低毒且靶向性强的纳米递送系统仍然面临着巨大挑战。本论文构建了基于血液、肿瘤组织以及细胞递送阶段具备不同特性的纳米纳米递送系统(HA/P-A cluster),共载化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)和免疫阻断抑制剂(p PD-L1 trap)。该纳米集簇初始尺寸约为180 nm,能够避免药物在血液中被清除,同时延长药物体内半衰期;达到肿瘤组织后,纳米集簇被肿瘤组织中高表达的金属机制蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)裂解为尺寸约为10 nm的小粒径纳米颗粒,増强药物在肿瘤组织中的渗透并且促进肿瘤细胞摄取DOX和p PD-L1 trap质粒。在肿瘤细胞中,纳米颗粒能够快速释放药物,DOX作用于癌细胞的DNA,将冷肿瘤转换为热肿瘤,诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡(Immunogenic cell death,ICD)并释放损伤分子相关模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs);p PD-L1 trap指导肿瘤细胞原位表达PD-L1 trap蛋白,该蛋白阻断PD-1/PD-L1通路,有效减轻PD-1+T细胞的免疫抑制状态,同时减少自身免疫症状的发生;二者联合使用,通过靶向递送到肿瘤部位,在诱导肿瘤细胞发生ICD的同时阻断PD-L1通路,杀灭肿瘤细胞并激活机体抗肿瘤免疫,起到“1+1>2”的协同抗癌作用。在第一章,制备了HA/P-A cluster纳米集簇并对其进行表征,对该纳米集簇的相关理化性质进行检测。首先,将DOX物理包封于小粒径阳离子聚合物PAMAM的疏水空腔内,通过调节二者的比例得到粒径为10 nm,带正电,购买MLN8237分散性好且载药率为23.53%的小尺寸纳米颗粒PAMAM@DOX。随后,通过层层自组装法获得纳米金PEI复合物(Au PEI),该纳米颗粒粒径约为8 nm,带正电。通过静电吸附将免疫治疗的基因药物p PD-L1 trap质粒负载于Au PEI表面得到Au-p PD-L1 trap,其粒径仍为8 nm。最后,以SMCC作为交联剂,通过MMP敏感的双功能肽R14将两种小粒径纳米颗粒交联为立体网状纳米集簇,用透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对纳米集簇进行包覆得到粒径为180 nm,带负电的纳米集簇(HA/P-A cluster)。HA/P-A cluster在低p H下可以缓释化疗药物DOX,且其粒径在体外7天内无明显变化,较为稳定。此外,该纳米集簇能够有效缩合DNA,且溶血率在实biological nano-curcumin验涉及的浓度下小于5%,安全性良好。在第二章中,对纳米集簇的体外体外抗肿瘤效果与生物学作用进行研究。首先通过流式细胞术与共聚焦显微镜,考察了纳米集簇的细胞摄取,对比游离p PD-L1trap与DOX,纳米集簇的细胞摄取量明显增多。通过MTT法与凋亡试剂盒评价纳米集簇诱导肿瘤细胞凋亡的能力,结果显示,纳米集簇可以有效诱导B16-F10细胞凋亡,细胞毒性与凋亡结果趋势一致。为了验证纳米集簇诱导肿瘤细胞发生ICD的能力,检测纳米集簇处理细胞后ICD标志分子钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和热休克蛋白(Heat shock protein 90,HSP 90)的表达,流式细胞术与免疫荧光法结果均显示,纳米集簇可以诱导肿瘤细胞高表达CRT和HSP 90,这表明纳米集簇可以高效诱导肿瘤细胞发生ICD。采用ELISA和化学发光法分别检测纳米集簇处理后肿瘤细胞高迁移率族蛋白HMGB1和ATP的释放,结果显示,纳米集簇处理后小鼠黑色素瘤细胞B16-F10释放到胞外的HMGB1和ATP含量大幅增加。此外,HA/P-A cluster还可以诱导B16-F10细胞表面MHC-I的表达,这意味着纳米集簇不仅可以诱发ICD,还能诱导细胞识别和呈递内源性抗原肽。最后,以GFP作为报告基因验证纳米集簇的体外基因转染效率,结果显示,纳米集簇的转染效率随着质量比的增加呈现先增加后减小的趋势,在30:1达到最佳。使用His标记的ELISA试剂盒检测这一比例下纳米集簇对p PD-L1 trap的转染效率,结果表示HA/P-A cluster可以有效转染p PD-L1 trap,诱导细胞表达PD-L1 trap蛋白,且随着纳米颗粒作用时间的延长,PD-L1 trap蛋白的累积释放量显著增加。在第三章中,首先构建了B16-F10细胞的小鼠荷瘤模型。定期记录治疗期间小鼠肿瘤体积和体重的变化,治疗结束三天后,处死小鼠并切除肿瘤组织与主要器官进行检测。结果显示HA/P-A cluster治疗可以有效延缓肿瘤生长,该组小鼠肿瘤体积小,瘤重轻,细胞凋亡数量多,抗癌效果显著。通过H&E染色验证了纳米集簇的生物安全性,HA/P-A cluster对小鼠主要器官无毒副作用,治疗期间小鼠体重变化不明显。通过免疫荧光法与流式细胞术对肿瘤组织进一步分析发现,纳米集簇的治疗增加了肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润,进一步印证了纳米集簇有效激活了机体的抗肿瘤免疫。综上,本课题构建了一种肿瘤微环境响应型纳米集簇,外包裹的HA增加了纳米集簇的稳定性,有助于纳米集簇实现体内长循环,此外,HA还与肿瘤细胞表面高表达的CD44相互作用进而主动靶向至肿瘤部位。HA/P-A cluster(180 nm)蓄积于肿瘤部位后,纳米集簇被MMP水解为两种粒径约为10 nm的小颗粒(PAMAM@DOX和Au-p PD-L1 trap)并经R14靶向介导进入肿瘤细胞。随后,纳米集簇负载的化疗药物DOX与免疫治疗基因药物PD-L1 trap在肿瘤细胞内发挥协同抗肿瘤作用。体内和体外实验结selleck Emricasan果都表明,纳米集簇可以有效诱导肿瘤细胞凋亡,延缓肿瘤生长,增加肿瘤部位CD8+T细胞的浸润,激活机体抗肿瘤免疫,通过协同效应增强癌症治疗效果,为设计和研发基于尺寸可变的纳米集簇提供技术路径,也为提升化学免疫治疗在抗肿瘤中的应用提供策略。