脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一类主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素。DON是谷物中最常见的单端孢霉烯族毒素,在我国乃至世界范围内都有严重的污染。人畜一旦误食经DON污染的粮谷和食物,不仅会导致恶心、呕吐、腹泻等急性毒性,还会导致食欲降低、生长速度变慢、动物饲料利用率降低、胃肠黏膜受损等毒性,给畜牧业的发展带来了巨大挑战。DON所致的细胞毒性、生长抑制、免疫毒性等已经被深入揭示,并揭示了信号通路在DON所致毒性损伤中的重要作用。然而DON所致炎性损伤的关键毒性基因或者靶点尚有待深入阐释。尽管氧化应激拮抗剂能够有效降低DON在细胞和动物上的部分毒性效应,但因其是非特异性拮抗剂,故存在特异性差、拮抗能力低等缺点,因此寻找针对DON所致炎性损伤的特异性拮抗剂依然有重要意义。随着分子生物学技术的不断发展,基于靶标筛选药物是医药行业寻找新型药物的主要方法。因此本课题组前期以J774A.1细胞为模型,利用CRISPR-Cas9全基因组筛选寻找DON发挥作用的关键靶标,发现MAP2K3基因缺失的细胞系能够有效抵抗DON所致的毒性效应,猜测MAP2K3为DON发挥炎性损伤中的关键靶标。本研究对MAP2K3在DON所致炎性损伤中的作用机制进行研究,从炎症、氧化应激、细胞凋亡三个方面在细胞水平上进行正反验证MAP2K3靶点的关键作用,并虚拟筛选MAP2K3蛋白的特异性抑制剂,然后从炎症、氧化应激、细胞selleckchem凋亡三个方面验证小分子抑制剂拮抗DON的毒性,并进一步验证结合位点的关键氨基酸残基,进一步在动物水平上验证药物能够拮抗DON的毒性作用,取得了以下结果:1.MAP2K3在DON所致的炎症反应中发挥关键作用通过蛋白免疫印迹(Western blot)试验发现,1μM,2μM和4μM的DON在1h内显著促进IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子的蛋白表达,并且促进p38、JNK、ERK1/2、p65蛋白的磷酸化程度,从而导致细胞的炎症反应。利用siRNA干扰MAP2K3后,IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达下调,且p38、JNK、ERK1/2、p65蛋白的磷酸化程度降低;超表达MAP2K3后,蛋白IL-6、IL-1β、TNF-αWnt-C59核磁的表达上调,且p38、JNK、ERK1/2、p65的磷酸化程度升高。说明DON主要通过MAP2K3激活下游p38通路导致炎症反应,当干扰MAP2K3后,p38的磷酸化程度降低,细胞的炎症反应也降低;超表达MAP2K3后,p38的磷酸化程度增强,细胞的炎症反应也加重。这表明MAP2K3在DON所致的炎症反应中发挥了关键作用。2.MAP2K3在DON所致的氧化应激中发挥了关键作用为了研究不同浓度的DON对细胞氧化应激的影响,通过流式细胞仪、酶标仪及Western blot检测ROS、MDA、SOD、GSH、NRF-2、NRF-1、p62、HO-1的含量,并通过透射电镜观察细胞的线粒体形态。结果表明不同浓度的DON显著上调ROS、MDA含量,并下调SOD、GSH含量,2μM、4μM的DON显著下调NRF-2、NRF-1、p62、HO-1的表达,并且1μM、2μM的DON会导致细胞线粒体肿胀、嵴消失、高尔基体空泡化,说明不同浓度的DON导致细胞氧化损伤。siRNA干扰MAP2K3后,ROS、MDA含量下降,SOD、GSH含量的升高,蛋白NRF-2、NRF-1、p62、HO-1表达升高,DON诱导的线粒体肿胀、嵴消失、高尔基体空泡化这些病变也得以逆转,说明干扰MAP2K3后,能够缓解DON导致的氧化损伤;超表达MAP2K3后,ROS、MDA含量升高,SOD、GSH含量下降,NRF-2、NRF-1、p62、HO-1的蛋白表达减少,说明超表达MAP2K3后,能够进一步诱导DON导致的氧化损伤。这表明MAP2K3在DON所致的氧化损伤中发挥了关键作用。3.MAP2K3在DON所致的细胞凋亡中发挥了关键作用为了研究不同浓度的DON对细胞凋亡的影响,通过流式细胞仪、荧光显微镜及WB检测Bax、Bim、Bcl-2、p53蛋白的表达及Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白的活化情况。结果表明不同浓度的DON显著诱导细胞凋亡,并上调Bim的表达及下调Bcl-2/Bax的比值,并促进p53蛋白的表达,并促进Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白的活化发挥细胞凋亡作用。siRNA干扰MAP2K3后,WB结果显示,Bim的表达下降及Bcl-2/Bax的比值升高,p53的蛋白表达下降,Caspase 3、Caspase9蛋白的活化情况下降,细胞的凋亡比例显著减少,说明干扰MAP2K3后,能够显著缓解DON导致的细胞凋亡;超表达MAP2K3后,Bim的表达升高及Bcl-2/Bax的比值降低,p53的蛋白表达升高,Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的蛋白活化情况升高,细胞的凋亡比例显著升高,说明超表达MAP2K3后,能够显著诱导DON导致的细胞凋亡。这表明MAP2K3在DON所致的细胞凋亡中发挥了关键作用。4.Ole能够抑制MAP2K3的表达,从而缓解DON所致的细胞炎症、氧化应激和凋亡损伤为了筛选MAP2K3蛋白的抑制剂来拮抗DON所致的细胞炎性损伤,首先利用SWISS MODEL对MAP2K3蛋白进行同源建模,应用SYBYL 2.0软件将MAP2K3晶体结构与准备好的小分子进行分子对接,结果发现打分前四名分别为甲基橙皮苷、Ole、诃子酸、槲皮素,利用Western blot试验发现甲基橙皮苷和Ole能够抑制MAP2K3蛋白的表达,并且CCK-8检测甲基橙皮苷和Ole具有极低的细胞毒性,但只有Ole能够缓解DON导致的细胞毒性。在细胞水平上进行Ole效果验证,结果表明20μM、40μM、60μM的Ole能够逆转DON导致的细胞炎症、氧化应激、凋亡损伤。进一步通过CETSA、DARST试验发现Ole通过与LYS149、SER194、TYR230氨基酸直接结合发挥抑制作用。在动物水平上,Ole能够缓解DON所致的食欲下降和体重生长降低,通过降低MDA,升高SOD、GSH、NRF-2、NRF-1、HO-1的含量,缓解肝脏的氧化损伤。总之,Ole通过与MAP2K3蛋白结Medicaid reimbursement合抑制其表达,从而逆转DON所致的细胞炎性损伤及动物的生长毒性和肝脏毒性。