近些年,由于人们生活水平的不断提高,肥胖和长期高脂饮食(High-fatdiet,HFD)日益增多。肥胖和HFD导致血液游离饱和脂肪酸(Saturated fatty acid,SFA)含量升高,而机体白色脂肪细胞数目有限,当包括SFA在内的脂质含量超过脂肪组织贮存能力和组织氧化利用能力时,游离SFA在血液中不断累积增多,继而进入并沉积于非脂肪细胞,引起这些组织细胞损伤,最终导致靶器官功能障碍。这种由于脂质的积累导致的细胞内稳态失调就是脂毒性(Lipid toxicity)。脂毒性主要影响肝脏、骨骼肌和胰岛β细胞,通过引起代谢障碍、炎症和氧化应激和内质网应激途径的激活,并可引发细胞死亡。这些改变会引起Ⅱ型糖尿病、心脏病和脂肪肝等疾病。越来越多的研究表明,脂毒性对神经元具有同样的危害,导致糖尿病脑病、阿尔茨海默病和抑郁症等疾病的发生。目前,针对脂毒性的危害,仍然是尚待解决的临床问题。未分级肝素(Unfractionatedheparin,UFH)是由O-硫酸化糖醛酸(α-L-艾杜糖醛酸或β-D-葡萄糖醛酸)和α-D-氨基葡萄糖(N-硫酸化,O-硫酸化或N-乙酰化)交替连接形成聚合物,由不同分子量的糖链组成的混合物。UFH具有抗凝、抗炎、抗铁调素和糖萼保护等多种生物学作用。由于其极性强、分子量大和带大量负电荷,所以不能通过血脑屏障。超顺磁氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)具有独特的物理化学性质,在各领域被广泛应用。裸露的SPIONs存在半衰期短、稳定性差的缺点,因此需要对其进行修饰。本课题组前期研制了肝素修饰超顺磁氧化铁纳米颗粒(Unfractionated heparin modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles,UFH-SPIONs),是以UFH为表面修饰剂通过静电作用对SPIONs进行修饰所获得的纳米体系,发现UFH-SPION粒径均一、稳定性好,无细胞毒性,具有类酶活性,能跨过癫痫动物大鼠血脑屏障、通过抗炎、抗氧化应激和抑制神经元凋亡机制发挥治疗大鼠颞叶癫痫的作用。SFA对神经元的脂毒性也同样存在炎症、氧化应激和神经元凋亡机制,因此我们猜测UFH-SPIONs或可以拮抗SFA所导致的神经元脂毒性。本课题以棕榈酸(Palmitic acid,PA)为SFA的代表,利用其作用于神经元细胞建立神经元脂毒性模型,从神经元能量代谢障碍、氧化应激及神经元活性三个方面探讨UFH-SPIONs抑制棕榈酸致神经元脂毒性的可能性,为研发拮抗SFA神经元脂毒性的新药奠定基础。研究主要内容及结果如下:1.UFH-SPIONs的制备、表征及细胞毒性的研究1.1 UFH-SPIONs 的制备本实验采用化学共沉淀法制备SPIONs和UFH-SPIONs。1.2 UFH-SPION中总铁离子含量测定采用邻菲啰啉分光光度法测量SPIONs和UFH-SPIONs的总铁离子浓度。SPIONs的总铁离子浓度为28 μg/mL。UFH-SPIONs的总铁离子浓度在100～160 μg/mL之间。1.3 UFH-SPIONs 中 UFH 含量测定采用甲苯胺蓝法测定了 UFH-SPIONs的UFH浓度。UFH-SPIONs的UFH浓度在110 μg/mL 左右。1.4 UFH-SPIONs聚集状态测定采用透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)检测,SPIONs 聚集明显,呈多颗粒团簇状态,而UFH修饰后的SPIONs呈分散状态,表明UFH-SPIONs稳定性好、分散性良好。1.5 UFH-SPIONs水动力学直径、多分散系数及Zeta电位测定采用动态光散射法(Dynamic light scattering,DLS)检测 SPIONs 和 UFH-SPIONs 的水动力学直径、多分散系数(Polymerdispersity index,PDI)和 Zeta 电位。UFH-SPIONs的水动力学直径和PDI均小于SPIONs;Zeta电位的绝对值显著高于SPIONs,表明UFH-SPIONs粒径均一、稳定性更好。1.6 UFH-SPIONs红外光谱表征采用傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform Infrared spectrometer,FT-IR)对SPIONs和UFH-SPIONs在波长2000～600 cm-1范围进行扫描并记录红外光谱图,表明UFH与SPIONs成功结合。1.7 UFH-SPIONs对神经元细胞毒性研究采用CCK-8法检测了 UFH和UFH-SPIONs对小鼠海马神经元细胞的影响,结果显示,50 μg/mL和100 μg/mL UFH均对小鼠海马神经元细胞增殖有抑制作用(P<0.01),细胞活性分别为68.24%和52.59%;而50 μg/mL和100 μg/mLUFH-SPIONs对小鼠海马神经元细胞增殖有促进作用(P<0.01),细胞活性分别为124.92%和119.74%。2.UFH-SPIONs对棕榈酸致神经元能量代谢障碍的影响2.1脂滴的检测利用棕榈酸建立小鼠海马神经元HT22细胞脂毒性细胞模型,利用油红O染色剂对脂质染色。结果显示,模型组细胞状态差,形态呈三角或不规则型,膜仁边界不清晰,细胞内有大量脂质沉积;与模型组相比,UFH-SPIONs组细胞状态良好,形态规则且细胞内只有极少数脂质沉积;UFH组细胞状态良好,形态规则,但细胞中有大量脂质沉积。2.2神经元膜流动性利用棕榈酸建立小鼠海马神经元脂毒性细胞模型,采用NBD-C6-HPC细胞膜染液标记细胞膜,利用荧光漂白技术,检测小鼠海马神经元细胞膜流动性。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠海马神经元细胞的膜流动性显著下降(P<0.01);与模型组相比,UFH-SPIONs组小鼠海马神经元细胞的膜流动性有显著提高(P<0.01),UFH组对棕榈酸引起的小鼠海马神经元细胞膜流动性下降没有显著的影响(P>0.05)。2.3神经元葡萄糖摄取的研究利用棕榈酸建立小鼠海马神经元脂毒性细胞模型,采用2-NBDG作为葡萄糖摄取示踪剂。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠海马神经元细胞葡萄糖摄取显著下降(P<0.01);与模型组相比,UFH-SPIONs组和UFH组小鼠海马神经元细胞葡萄糖摄取明显升高(P<0.0.1);UFH-SPIONs组与UFH组相比,前者促进葡萄糖摄取作用更强(P<0.01)。2.4神经元内ATP含量的测定利用棕榈酸建立小鼠海马神经元脂毒性细胞模型,采用酶联免疫吸附实验法检测ATP含量。与对照组相比,模型组小鼠海马神经元产生的ATP含量显著下降(P<0.01);与模型组相比,UFH-SPIONs组与UFH组小鼠海马神经元产生ATP显著升高(P<0.01);UFH-SPIONs组与UFH组相比,前者保护神经元能量代谢系统作用更显著(P<0.05)。3.UFH-SPIONs对棕榈酸致神经元氧化应激的影响3.1 P-JNK/NADH脱氢酶氧化应激通路的研究利用棕榈酸建立小鼠海马神经元脂毒性细胞模型,利用酶联免疫吸附实验法检测磷酸化c-JNK氨基末端激酶(P-JUN N-terminal kinase,P-JNK)、NADH脱氢酶含量,采用DCfolk medicineFH-DA荧光探针标记活性氧(Reactive oxygen species,ROS),检测细胞内荧光强度。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠海马神经元细胞P-JNK含量、胞内ROS荧光强度均显著升高(P<0.01),同时NADH脱氢酶含量显著下降(P<0.01);与模型组相比,UFH-SPIONs组和UFH组小鼠海马神经元细胞P-JNK含量(分别为P<0.01、P<0.05)和胞内ROS荧光强度均显著降低(分别为P<0.01、P<0.05),同时,NADH脱氢酶显著升高(分别为P<0.01、P<0.05)。结果表明,UFH-SPIONs通过调控P-JNK/NADH脱氢酶通路抑制氧化应激水平。3.2 UFH-SPIONs对氧化还原酶保护作用的研究利用棕榈酸建立小鼠海马神经元脂毒性细胞模型,利用ELISA检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase one,NOS1)和过氧化物酶(Peroxidase,Pselleck HPLCOD)。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠海马神经元细胞中SOD酶和POD酶含量均下降(P<0.01),同时NOS1酶含量升高(P<0.01);与模型组相比,UFH-SPIONs组与UFH组的SOD酶(P<0.01和P<0.05)和POD酶含量明显升高(P<0.01),NOS1酶含量也明显下降(P<0.01)。这表明UFH-SPIONs对小鼠海马神经元细胞的抗氧化酶具有保护作用,具有抗氧化应激作用。4.UFH-SPIONs对棕榈酸致神经元凋亡的影响利用棕榈酸建立小鼠海马神经元脂毒性细胞模型,利用CCK-8法检测UFH-SPIONs和UFH对脂毒性小鼠海马神经元细胞活性的影响,采用酶联免疫吸附实验法检测细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C),采用Fluo-4荧光探针标记胞内钙离子,采用JC-1荧光探针检测细胞内线粒体膜电位。结果显示,棕榈酸对小鼠海马神经元细胞有细胞毒性(P<0.01);棕榈酸作用于HT22细胞还引起细胞内钙离子含量、Cyt-C含量均显著升高(P<0.01);与对照组(383.81%)相比,JC-1聚合物/单体荧光强度比值(14.68%)显著降低(P<0.01),线粒体主要呈绿色荧光,表现出非常低的线粒体膜电位。UFH-SPIONs对棕榈酸致小鼠海马神经元细胞毒性有显著的抑制作用,并显示出显著的促进HT22细胞增殖的作用(P<0.01);与模型组相比,UFH-SAG-221价格PIONs组细胞内钙离子含量、Cyt-C含量均显著降低(P<0.01);UFH-SPIONs可以使棕榈酸引起的下降的线粒体膜电位明显升高,JC-1聚合物/单体荧光强度比值显著升高(184.67%,P<0.01)。UFH组对棕榈酸致小鼠海马神经元细胞毒性没有保护作用,显示出对神经元增殖的进一步抑制作用(P<0.01),与模型组相比,UFH组细胞内钙离子含量、Cyt-C含量显著降低(P<0.01);UFH对棕榈酸引起的下降的线粒体膜电位有显著恢复作用,JC-1聚合物/单体荧光强度比值显著升高(69.74%,P<0.01)。总之,本课题采用化学共沉淀法制备了粒径均一、稳定性好且无神经元细胞毒性的UFH-SPIONs,并证实UFH-SPIONs可以通过调节能量代谢障碍、氧化应激和细胞活性三条通路,发挥拮抗棕榈酸所引起的这些神经元脂毒性作用。这表明,UFH-SPIONs对存在神经元脂毒性损伤的疾病,如糖尿病脑病、早老性痴呆方面的潜在应用值得深入研究。