酶作为常用的生物催化剂,因为其高效的催化能力和突出的立体选择性,在日常的生产生活中发挥着重要的作用。然而随着工业化学品的类型增多以及需求日益增大,现有的酶促www.selleck.cn/products/CP-690550反应已经不能满足实际的需求。而酶催化非天然反应的提出,逐渐成为生化领域的一大热点,相比于传统酶催化的专一性,酶催化非天然反应的发掘,为绿色化学的发展提供了一条新途径。血红素蛋白是自然界中存在最为广泛的蛋白家族之一,利用其自身的血红素辅基可以发挥多种生物学功能。而血红蛋白作为其中最为常见的一种蛋白,其催化非天然反应的能力还并未被发掘。本论文围绕血红蛋白的过氧化物酶活力以及卡宾转移酶活力进行探究,并结合定向进化与蛋白质工程,对其催化的非天然反应类型进行扩展。主要研究内容和结果如下:(1)针对透明颤菌血红蛋白(VHb)的过氧化物酶活力,对其催化氧化反应的类型进行了研究,以亚氨基酚醛为底物通过VHb催化的氧化环化反应高效合成2-取代苯并噁唑类化合物。我们在该研究中对具体的反应条件进行了优化,包括:酶源种类与用量,溶剂,添加剂,氧化剂种类,底物适用性,并对反应的催化机理进行了初步推测。(2)基于血红蛋白具有的过氧化物酶活力,设计血红蛋白-葡萄糖氧化酶双蛋白系统在水溶液中绿色合成β-酮砜类化合物,以氧气为唯一氧化剂,将烯烃/炔烃和苯亚磺酸钠转化成相应产物,并对蛋白来源,双蛋白比例,底物用量等反应条件进行优化。在最适条件下合成了一系列的β-酮砜类化合物,证明了该反应的底物适用谱广且对各种基团的耐受性较高。后续通过同位素标记实验,证明产物羰基氧原子来源于空气中氧气,进而对双蛋白反应可能的催化机理进行了推测。(3)针对VHb的卡宾转移酶活力进行挖掘,设计S-H插入反应展开研究,根据以往文献报告,采用定点饱和突变对与配体结合时最关键的Q53位点进行了改造,得到了具有高活性和一定立体选择性的卡宾转移酶突变株。成功提高了VHb催化重氮化物和苯硫酚以及硫醚类化合物之间卡宾转移反应的能力,并扩展了其底物范围,为手性C-S键的构建提供了理论基础。(4)基于血红蛋白具有的卡宾转移酶活力,论文建立了血红蛋白-脂肪酶双蛋白串联一锅法合成喹喔啉类化合物的转化方法。以邻苯二胺、β-酮酯、对甲苯磺酰叠氮为底物对双蛋白系统的最佳反应条件进行了探究,合成了一系列的喹喔啉衍生物。与传统化学方法相比,双蛋白系统展现出更高的区域选择性。同时通过放大实验,证明了该双蛋白系统催化喹喔啉选择性合成的工业实用性,最后结合对照实验提出了该双蛋白体系的机理,证明该双蛋白反应是由脂肪酶和血红蛋白的活性空腔共同起催化作用所完成的。(5)基于上述的研究,论文同时聚焦于血红蛋白的过氧化物酶活力以及卡宾转移酶活力的调控。通过定点饱和突变和随机突变相结合,获得了同时具有高卡宾转移酶和过氧化物酶活力的突变体,相比于野生型蛋白,最佳突变体的卡宾转移酶和氧化酶活性分别提高了6.7倍和17倍。通过对VHb进行定向进化改造来实现对非天然氨基酸类化合物的高效购买Canagliflozin合成。突变体蛋白催化以胺、重氮化合物和烷基硼酸为底物一锅法合成相应的非天然氨基酸衍生物(TTN可达9400)。后续通过分子对接实验,模拟了底物与活性位点的相互作用,进一步的阐述了双功能VHb的催化机理。最后,利用VHb突变体催化结合化学法高效地合成了抗癫痫药物左乙拉西坦,证明了该生物Novel PHA biosynthesis催化系统的实用性。综上,本论文对血红蛋白所催化的非天然反应进行了探索,挖掘了血红蛋白的过氧化物酶活力和卡宾转移酶活力,提出了多种血红蛋白催化的新型氧化反应和卡宾转移反应。为血红蛋白的基础研究和工业发展提供了数据支持,扩展了血红蛋白在合成、催化领域的应用。