【目的】伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)是儿童最常见的非霍奇金淋巴瘤,具有高度侵袭性,恶性进展快。临床常采用短周期大剂量强化多药化疗方案治疗,治愈率达80～90%,但仍有10～20%复发或死亡。目前利妥昔单抗(CD20抗体)可用于治疗95%复发或化疗耐药患者,治疗效果好,但仍有5%左右患者因耐利妥昔单抗而治疗效果不佳,3年生存率低,预后购买Lorlatinib极差。目前对于这部分患者尚缺乏有效的治疗方式,因此亟待探寻发现一种新的有效治疗方式。近来基于外泌体(Exosomes,Exo)的免疫治疗已成为颇具前景的肿瘤免疫治疗方式。有研究报道显示,自然杀伤细胞来源的外泌体(Nature killing cells derived Exosomes,NK Exo)可用于杀伤黑色素瘤、神经纤维瘤细胞等。我们前期也发现NK Exo可用于儿童神经母细胞瘤、白血病的免疫治疗。目前还尚未见有NK Exo用于寻找更多BL的免疫治疗研究。因此,本研究将首次对此展开研究。我们将采用辐照K562细胞联合细胞因子(IL-2/IL-15)体外诱导培养方式对外周血来源的NK细胞进行扩增;同时为了获得更多高效活化的NK Exo用于BL细胞杀伤,将通过基因工程技术对K562细胞进行改造,使其膜表面表达IL21,获得膜结合IL-21(Membrane binding IL-21,mb IL-21)的K562细胞,使其对NK细胞的刺激活化作用更强,分泌Exo更多、活性更强;而后将获得的NK Exo用于BL细胞株(Raji细胞)及耐利妥昔单抗细胞株(ARH-77细胞)的免疫杀伤,以期发现一种新的可用于BL的免疫治疗手段,从而为BL治疗提供新的研究思路和理论依据。【方法】采用同源重组法构建mb IL-21慢病毒质粒;借助转染试剂聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)将其转染入HEK 293 T细胞后,收集病毒液感染K562细胞,并使用嘌呤霉素筛选mb IL-21阳性的K562细胞株,通过蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验检测mb IL-21 K562细胞中IL-21的表达情况;确认IL-21高表达后,将mb IL-21 K562细胞、未转染mb IL-21 K562细胞经100 Gy X射线辐射处理后分别与健康捐赠者的外周血PBMC按照1:1的细胞比例共培养14天,同时添加细胞因子IL-2、IL-15体外诱导外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)分化为NK细胞。通过流式细胞术检测强细胞杀伤毒性NK细胞(CD3~-CD56~+CD16~+)所占比例;通过台盼蓝计数法结合流式细胞术检测的CD56~+CD16~+所占比例推算强细胞杀伤毒性NK细胞数量。通过聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)沉淀法利用PEG 8000从NK细胞培养上清液中获得活化的NK Exo。采用透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)检测NK Exo膜结构及粒径大小。采用纳米颗粒追踪仪(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)检测NK Exo的粒径及其峰值分布范围、颗粒密度。蛋白免疫印迹WB检测NK Exo的标志性蛋白CD63、CD81以及与NK细胞杀伤相关的穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B的表达。将活化的NK Exo与Raji细胞和ARH-77细胞分别共培养,采用流式细胞术检测在不同培养时间点Raji和ARH-77细胞的凋亡情况和细胞周期的变化情况。【结果】通过同源重组法成功构建mb IL-21-PCDH质粒,酶切鉴定阳性的重组质粒测序结果显示与mb IL-21设计序列比对完全一致;将mb IL-21-PCDH慢病毒质粒转染入HEK 293 T细胞并获得病毒液感染K562细胞后,使用嘌呤霉素筛选培养获得了阳性mb IL-21 K562细胞株;WB结果显示mb IL-21 K562细胞中的IL-21蛋白量明显高于未转染mb IL-21的K562细胞,以此成功建立了K562改造细胞株(mb IL-21 K562细胞株)。将mb IL-21 K562细胞、未转染mb IL-21 K562细胞经100 Gy X射线辐射处理后分别与健康捐赠者的外周血PBMC按照1:1的细胞比例与IL-2、IL-15联合诱导培养PBMC共培养14天,流式细胞结果显示随培养时间延长,NK细胞(CD3~-CD16~+CD56~+细胞)数量不断增加,在共培养第14天,mb IL-21 K562细胞组刺激的NK细胞比例可达90.4%,而未转染mb IL-21K562细胞组刺激的NK细胞比例为40.10%。采用本实验室自制的Exo体外大规模分离提取法对NK细胞培养上清提取分离NK Exo。TEM显示NK Exo具有典型双层膜结构,直径100～200 nm;NTA检测到NK Exo粒径范围在100～200 nm,粒径分布峰值约131.3～147.2 diameter/nm,浓度为1～3.8×10~(11)颗粒/ml;WB结果检测其有标志性蛋白CD63、CD81表达,此外还检测到穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B蛋白的表达,以此获得了高浓度活化的NK Exo。将NK Exo(3μg/μl)分别作用于Raji、ARH-77细胞6 h、24 h后,通过Annexin V-FITC和PI双染法进行流式细胞分析,结果显示:随时间延长至24 h,Raji细胞和ARH-medical coverage77细胞均发生显著凋亡,凋亡率分别为79.6%、82%。此外,PI单染流式细胞检测结果显示,将NK Exo(3μg/μl)分别作用于Raj、ARH-77细胞24 h后,G1期细胞显著增加,S期、G2期细胞降低。说明活化NK Exo可诱导Raji及ARH-77细胞发生凋亡并将细胞周期阻滞在G1/S期。【结论】1.成功建立了可用于体外显著扩增NK细胞的K562改造细胞株(mb IL-21K562细胞株),该细胞株经X射线辐照后可刺激NK细胞快速活化并大量扩增,后经IL-2、IL-15诱导培养14天后,可获得高扩增效率、高纯度、活化的NK细胞,这些细胞均高表达CD56、CD16分子。2.通过本实验室自建的Exo体外大规模分离提取法可从NK细胞培养上清中分离获取大规模的NK Exo;提取NK Exo浓度高,粒径均一,具有典型Exo双层膜结构,且表达Exo标志性蛋白CD63、CD81;同时还表达NK细胞肿瘤杀伤物质—穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B。3.分离获得的活化NK Exo可诱导Raji及ARH-77细胞发生凋亡及细胞周期阻滞。4.通过mb IL-21 K562细胞株刺激培养获取的活化NK Exo对BL(含复发/耐药BL)具有潜在的免疫治疗作用。