目的 对程序性死亡受体配体2(Programmed cell Death 1 Ligand 2,PD-L2)进行泛癌症分析,以探索其表达分布、功能作用、预后指导意义和免疫治疗疗效预测价值。方法 本研究应用R语言“gsub”、“avereps”和“sapply”等命令提取肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和国际肿瘤基因组协作组(International Cancer Genome Consortium,ICGC)数据库中 PD-L2 编码基因pdcdllg2 mRNA 在 33种人类恶性肿瘤组织和国际范围内8种恶性肿瘤中的表达水平。对人类蛋白图谱数据库(Human Protein Atlas,HPA)中19种恶性肿瘤的免疫组化染色结果进行分析,明确PD-L2蛋白在肿瘤组织中的表达分布。应用R语言中“quantile”等命令将pdcdllg2 mRNA表达水平由低向高排序,并将其分为表达量最低30%组和最高30%组,随后利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)软件以京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)基因集和 Reactome 基因集为参照进行功能富集分析。应用R语言“estimateScore”等命令计算泛癌症中pdcd1lg2mRNA的表达与肿瘤基质细胞评分和肿瘤免疫细胞评分的相关性。应用R语言“cor.test”等命令利用Spearman相关性检验确定pdcd1lg2 mRNA的表达与免疫调节分子(免疫刺激分子、免疫抑制分子、趋化因子及趋化因子受体)mRNA表达以及肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden,TMB)和微卫星不稳定(MicroSatellite Instability,MSI)之间的相关性。在检索相互作用基因的搜索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)数据库中设置“minimum required interaction score”为0.700以识别与PD-L2相互作用的分子。在TIMER数据库中“Gene”亚模块计算21种不同免疫细胞类型浸润丰度与pdcd1lg2 mRNA表达水平间的相关性。分别应用R语言“survfit”等命令和“coxph”等命令进行Kaplan-Meier生存分析及Cox回归分析明确pdcd1lg2 mRNA与患者总生存期(Overall Survival,OS)或无进展生存期(Progrselleck抑制剂ession-Free Survival,PFS)的关系。在肿瘤免疫同基因小鼠(Tumor Immune Syngeneic MOuse,TISMO)数据库中选择“Gene”模块输出pdcd1lg2 mRNA 在多个小鼠恶性肿瘤免疫治疗队列中不同治疗反应组中的表达差异。利用肿瘤免疫功能障碍和排斥(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion,TIDE)数据库中“Biomarker Evaluation”模块比较7种常见免疫治疗疗效标记物和pdcd1lg2 mRNA的表达在恶性肿瘤免疫治疗疗效预测中的准确度。结果 来自TCGA数据库的33种肿瘤组织内和来自ICGC中12个肿瘤数据集的8种肿瘤组织中均表达pdcdllg2 mRNA,但不同肿瘤类型之间表达水平差异较大;同一部位恶性肿瘤的不同病理亚型之间其表达量不完全一致;不同部位的同一病理类型恶性肿瘤中其表达量也可能存在差异。与pdcd1lg2 mRNA表达趋势相似,PD-L2蛋白在HPA数据库19种恶性肿瘤组织中广泛表达,其既可以表达在肿瘤细胞上,也可以表达在间质细胞上。GSEA功能富集结果提示泛癌症中pdcd1lg2mRNA的表达与多条免疫功能相关通路相关,例如ANTIGEN PROCESSING AND PRESENTATION(抗原加工与提呈)和 TCR SIGNALING(TCR 信号)等;同时与 TNFR2 NON CANONICAL NF-KB PATHWAY(TNFR2 非经典 NF-κB 通路)和 REGULATED NECROSIS(调节性坏死)等非免疫相关通路相关。除胸腺瘤外,TCGA数据库中其他32种恶性肿瘤组织中pdcd1lg 2mRNA的表达与肿瘤免疫细胞评分和肿瘤基质细胞评分均呈正相关(R>0.25,p<0.05)。Spearman相关性分析结果发现pdcd1lg2 mRNA的表达与多种免疫刺激分子的表达呈负相关(Cor<0,p<0.05),例如ULBP1、TNFSF9和TNFSF15等;与多种免疫抑制分子的表达呈正相关(Cor>0,p<0.05),例如TIGIT、PDCD1和LAG3等。STRING数据库同样发现PD-L2与多种免疫相关分子相互作用,例如PD-1,CD3和CD28等。基于以上结果,我们基本确定PD-L2在泛癌症中与肿瘤免疫杀伤过程密切相关,接下来我们主要研究PD-L2与免疫细胞的关系。利用TIMER中多种算法分析确定pdcd1lg2mRNA的表达与多种免疫细胞(例如CD8+T、B细胞、巨噬细胞和树突细胞等)的浸润相关,尤其与结肠癌肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的丰度呈强程度正相关(EPIC 算法:Rho=0.917;MCP-COUNTER 算法:Rho=0.913;XCELL算法:Rho=0.818;TIMER算法:Rho=0.496)。针对PD-L2的临床应用研究中,Kaplan-Meier生存分析提示pdcd1lg2 mRNA的高表达与结肠癌(P=0.032)、膀胱尿路上皮癌(p=0.011)和肾乳头状细胞癌(p=0.01)等10种恶性肿瘤患者的不良预后相关,而与乳腺浸润癌(p=0.021)、宫颈癌(p=0.011)和食管癌(p=0.044)等10种恶性肿瘤患者的较好预后相关;Cox回归分析发现pdcd1lg2mRNA的高表达是肾乳头状细胞癌(p=0.009)、低级别胶质瘤(p<0.001)和胸腺瘤(p=0.010)患者预后的危险因素,是皮肤黑色素瘤(p<0.001)患者预后的保护性因素。针对PD-L2在患者免疫治疗疗效预测的评价中,虽然泛癌症pdcd1lg2 mRNA的表达与TMB和MSI相关,但其相关性均较弱(R<0.4);在65个荷瘤小鼠免疫治疗队列中,肿瘤组织中pdcd1lg2 mRNA的表达在21个队列中发生变化,其中在19个队列中对治疗产生反应的小鼠肿瘤组织中pdcd1lg2 mRNA的表达水平相比较基线水平升高(p<0.05);在15个肿瘤患者免疫治疗队列中pdcd1lg2 mRNA预测免疫治疗疗效的精确度大于50%(AUC>0.5),其预测能力优于MSI评分和B克隆。结论T-cell immunobiology 在泛癌症肿瘤组织中,PD-L2的表达能够在多条免疫相关功能通路上富集,同时与多种免疫相关分子表达相关,因此其在肿瘤免疫微环境中发挥重要作用。值得注意的是,其可能在结肠癌组织中高表达于肿瘤相关巨噬细胞上。除此之外,PD-L2具有多种肿瘤患者预后指导价值及免疫治疗疗效预测价值。目的 通过前一部分对TIMER数据库中数据进行分析发现相比较其他肿瘤组织中的其他免疫细胞,pdcd1lg2 mRNA的表达与结肠癌肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophage,TAMs)的丰度呈最强程度正相关(EPIC 算法:Rho=0.917;MCP-COUNTER 算法:Rho=0.913;XCELL 算法:Rho=0.818;TIMER 算法:Rho=0.496)。因此本部分研究将验证肠癌组织中PD-L2的表达分布及进一步探索TAMs上PD-L2的表达对肿瘤进展的影响及其作用机制。方法 应用肿瘤免疫单细胞集合(Tumor Immune Single-cell Hub,TISCH)数据库对8个肠癌肿瘤组织单细胞测序数据集进行数据分析了解pdcd1lg 2mRNA在肿瘤细胞、免疫细胞及间质细胞上的表达分布。取7例既往于中国医学科学院肿瘤医院行手术治疗的结肠癌患者肿瘤组织石蜡切片,进行PD-L2和CD68多重免疫荧光染色分析PD-L2在TAMs上的表达;另取3例于中国医学科学院肿瘤医院行手术治疗的结肠癌患者新鲜肿瘤组织,解离为单细胞悬液后进行流式细胞学分析检测免疫细胞及肿瘤细胞上PD-L2的表达。构建小鼠MC38结肠癌细胞系皮下移植瘤模型,在建模后不同时间点(第7天,第14天,第21天和第28天)采用流式细胞学技术分别检测免疫细胞及肿瘤细胞上PD-L2的表达并于第14天流式分选肿瘤中PD-L2-TAMs和PD-L2-TAMs以用于后续实验。在肿瘤细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)数据库“Expression&CN”模块对人结肠癌细胞系RNA测序数据进行分析,并应用R语言“ggplot”等命令输出pdcd1lg 2mRNA在人肿瘤细胞系上的表达水平。对6种人结肠癌细胞系及3种小鼠结肠癌细胞系进行Western Blot检测确定肿瘤细胞上PD-L2的表达。提取小鼠原代骨髓来源巨噬细胞并将其诱导极化为M1和M2型巨噬细胞,随后采用qRT-PCR和流式细胞学分析分别检测PD-L2-TAMs、PD-L2TAMs、M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞上M1和/或M2标志物以确定PD-L2-TAMs的极化方向。将PD-L2-TAMs和PD-L2-TAMs与大肠杆菌混合后,流式细胞学检测其吞噬细菌的数量以了解其吞噬能力。使用流式细胞学分析明确PD-L2+TAMs和PD-L2-TAMs 中溶酶体相关膜蛋白 1(Lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)、LAMP2和Ki-67的表达以了解细胞溶酶体状态和增殖能力。应用Transwell培养模式共培养PD-L2-TAMs/PD-L2-TAMs和肠癌细胞MC38细胞系24小时或48小时,染色后计数发生迁移及侵袭的肠癌细胞个数;同样应用Transwell培养模式共培养两类TAMs和肠癌细胞MC38细胞系7天,计数肿瘤细胞克隆形成的数量。分离小鼠原代T细胞并在CD3和CD28活化条件下共培养PD-L2+TAMs/PD-L2-TAMs和T细胞,流式细胞学检测表达Ki-67和产生干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)的CD8+T细胞的比例。对流式分选得到的PD-L2+TAMs和PD-L2-TAMs进行RNA测序后确定特异性表达基因,并按照差异倍数|log2FC|≥1,显著性Qvalue<0.05筛选差异基因并进行GO和KEGG富集分析。收集PD-L2+TAMs和PD-L2-TAMs培养48小时后的培养上清,进行细胞因子蛋白芯片检测以了解二者分泌细胞因子的差异。结果 通过对TISCH数据库中8个肠癌肿瘤组织单细胞测序数据集分析发现PD-L2编码基因pdcd1lg2 mRNA主要在肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)中的免疫细胞和间质细胞上表达,尤其表达在单核细胞/巨噬细胞细胞群;而在肿瘤细胞上不表达。进一步收集结肠癌患者肿瘤组织进行验证,发现7名入组的结肠癌患者中,4名患者TME中TAMs上表达PD-L2,其数量约占TAMs数量的20%;而3名患者几乎不存在双阳性细胞。流式细胞学分析发现结肠癌患者肿瘤组织中CD8+T细胞可以分为PD-L2HighCD8+T细胞(Ⅰ群)和PD-L2LowCD8+T细胞(Ⅱ群),两者所占CD8+T细胞的比例分别为51.11±7.26%和8.23±5.55%;约34.8±2.55%的B细胞表达PD-L2;而树突状细胞和肿瘤细胞不表达PD-L2。随后通过对小鼠MC38结肠癌皮下移植瘤模型不同时间点肿瘤组织进行流式细胞学分析发现PD点击此处-L2+TAMs细胞群、PD-L2+CD4+T细胞群和PD-L2+CD8+T细胞群的数量并不恒定,而是随肿瘤体积的变化而变化;其中PD-L2+TAMs数量峰值为第 14 天(30.35±5.45%),而PD-L2+CD4+T细胞和PD-L2+CD8+T细胞数量峰值均为第7天。为进一步确认肿瘤细胞上是否可以表达PD-L2,本研究对CCLE数据库中73种人结直肠癌细胞系转录组数据进行分析发现其中24种细胞系不表达pdcd1lg2mRNA,41种细胞系上其表达水平极低。取其中6种人肠癌细胞系和3种小鼠肠癌细胞系进行Western Blot检测发现PD-L2蛋白表达水平与CCLE数据库中对应细胞系的pdcd1lg2 mRNA表达水平趋势一致。综上,因结肠癌组织中PD-L2主要表达在TAMs上,后续实验主要探索PD-L2+TAMs的性质及功能。qRT-PCR或流式细胞学分析发现相比较PD-L2-TAMs,PD-L2+TAMs上M2 型标志物(CD206、Arg-1、IL-10、TGF-β和Ym1)的表达水平更高(p<0.05),与小鼠骨髓来源M2型巨噬细胞上标志物的表达水平相近,因此认为其更趋向于M2型。采用流式细胞学检测发现虽然PD-L2+TAMs较PD-L2TAMs吞噬大肠杆菌数量增多,但差异并无统计学意义(p>0.05)且两类TAMs均有较强的溶酶体活性。除此之外,流式细胞分分析发现小鼠结肠癌皮下移植瘤中几乎所有TAMs(包括PD-L2+TAMs和PD-L2TAMs)均具有强增殖能力。在对肿瘤进展进行研究时发现相比较PD-L2-TAMs,PD-L2+TAMs能够增加肿瘤细胞的迁移(p<0.001)、侵袭(p<0.05)和增殖(p<0.05)能力;同时其可以抑制T细胞的活化和增殖,但并无统计学意义(p>0.05)。最后对两类TAMs进行转录组测序,共有14834个基因为PD-L2+TAMs和PD-L2-TAMs共有,而有576个基因为PD-L2+TAMs特有,有670个基因为PD-L2-TAMs特有;与PD-L2-TAMs相比,PD-L2+TAMs有308个基因的表达出现上调,1 13个基因的表达出现下调。对上调基因进行KEGG通路富集分析发现其主要富集在“Cytokine-cytokine receptor interaction”等通路上;继续收集两种TAMs分选后细胞培养上清,检测308种细胞因子分泌。结果发现PD-L2+TAMs相比较PD-L2-TAMs高表达Resistin和VEGFR1等促肿瘤细胞因子,而低表达MIP-1α等抑肿瘤细胞因子。结论 TAMs通过表达PD-L2进而高分泌Resistin、VEGFR1,低表达MIP-1α,从而影响肿瘤细胞的生物学行为,促进结肠癌肿瘤进展。