研究目的:丰富环境(Enriched environment,EE)预处理可有效预防脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。然而,EE预处理的神经保护机制尚不清楚。大量研究报道,内质网应激在I/R损伤中广泛存在。轻度的内质网应激促进细胞脱离危险信号进入适应性过程,激活促生存机制挽救缺血损伤,而长期的内质网应激大多通过触发多种促凋亡机制损害神经细胞。本研究旨在探讨内质网应激介导的自噬和凋亡在I/R损伤中的作用及其潜在的调节机制,为进一步深入探究EE产生神经保护作用的分子机制提供研究基础,为脑缺血的预防提供新思路。研究方法:56只雄性Sprague Dawley大鼠在标准环境(Standard environment,SE)或EE中饲养4周后进行假手术或大脑中动脉闭塞/再灌注(Middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)以建立脑缺血损伤动物模Trimmed L-moments型。术后将大鼠分为假手术组、MCAO组和MCAO+EE组。应用激光血流散斑成像技术监测术前、闭塞中和再灌注后的脑血流状况。术后第0、24和48小时分别通过Zea Longa评分观察大鼠神经功能缺损程度。大鼠于术后48h全身麻醉断头处死,立即进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride,TTC)染色,计算脑梗死体积。苏木精-伊红染色法(Hematoxylin and eosin staining,HE)观察半暗带神经元的形态结构。免疫印迹法检测大鼠皮层内质网应激相关蛋白(GRP78、p-PERK/PERK、p-IRE1/IRE1、ATF6、ATF4、CHOP和p-JNK/JNK)、自噬相关蛋白(LC3II/I、Beclin-1和p62)和细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达。同时采用TUNEL染色检测细胞凋亡水平,免疫荧光法检测p-PERK、p-IRE1和LC3的表达。研究结果:1.丰富环境预处理可减少大鼠脑梗死体积以及减轻急性期神经元损伤为了评估MCAO/R模型的成功建立,本研究首先使用激光散斑血流成像技术监测了手术前、术中和术后大鼠脑血流量(Cerebral blood flow,CBF)的变化。结果显示MCAO组和MCAO+EE组大鼠的CBF分别下降至基线的22.33%和17.57%。表明本实验所需的脑缺血再灌注模型制备成功。TTC结果显示,相较于MCAO组,MCAO+EE组大鼠脑梗死体积显著减少(P<0.01)。Longa评分用于测试大鼠神经功能缺损情况。分析表明,在MCAO/R后48h,MCAO+EE组大鼠神经功能缺损得分明显少于MCAO组且具有显著性差异(P<0.01)。此外,HE染色结果显示MCAO组大鼠皮层神经元细胞排列紊乱并伴有形态肿胀、细胞膜破裂,表明大量神经元细胞死亡。而MCAO+EE组神经元结Dolutegravir构和完整性得到明显改善,神经元死亡显著减少。表明EE预处理可减轻脑I/R损伤引起的急性神经元损伤。2.丰富环境预处理可缓解缺血再灌注损伤引起的内质网应激MCAO/R术后48小时,对大鼠进行麻醉处死,通过免疫印迹法检测内质网应激水平。结果显示,MCAO+EE组中内质网应激标志物GRP78的表达低于MCAO组,具有统计学差异(P<0.05)。未折叠蛋白反应中的三个内质网跨膜受体p-PERK/PERK,p-IRE1/IRE1以及ATF6在蛋白水平上,MCAO组的表达相较于MCAO+EE组显著升高,且具有显著差异(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。此外,MCAO组中p-PERK以及p-IRE1的荧光强度高于MCAO+EE组(P<0.001,P<0.05)。提示缺血前EE预处理可显著抑制I/R损伤诱导的内质网应激。3.丰富环境预处理抑制缺血再灌注损伤后的自噬活性由于内质网应激介导的自噬在I/R损伤中起着至关重要的作用,本研究继续探索了EE预处理是否对自噬有影响。免疫印迹和免疫荧光检测了自噬标志物LC3的表达情况。结果显示,相较于MCAO组,MCAO+EE组LC3II/I的蛋白表达以及荧光强度均显著下降(P<0.GSK J4细胞培养01)。此外,MCAO+EE组Beclin-1的蛋白表达低于MCAO组(P<0.01),p62的蛋白表达高于MCAO组,均有统计学差异(P<0.05)。提示EE预处理能够抑制I/R损伤引起的自噬水平。4.丰富环境预处理可减轻缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡通过TUNEL染色检测大鼠患侧皮层细胞凋亡情况。MCAO+EE组细胞凋亡指数明显低于MCAO组(P<0.01)。此外,利用免疫印迹检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。结果表明,相较于假手术组,MCAO组中Bcl-2的表达下降(P<0.001),Bax的表达增加(P<0.001);而相对于MCAO组,MCAO+EE组增加了Bcl-2的表达(P<0.01),并减少了Bax的表达(P<0.05)。5.缺血前丰富环境预处理对内质网应激下自噬和凋亡相关信号通路的影响本研究通过免疫印迹评估了PERK信号通路下ATF4和CHOP以及IRE1信号通路下p-JNK/JNK的蛋白表达水平。结果显示,以上三种蛋白表达水平在MCAO+EE组中均高于MCAO组(P<0.05,P<0.001,P<0.01)。提示在长时间内质网应激下,EE预处理减弱I/R损伤介导的自噬和凋亡可能与激活PERK-ATF4-CHOP通路和IRE1-JNK通路有关。研究结论:1.丰富环境预处理可抑制脑缺血再灌注后引起的内质网应激,自噬活性和凋亡。2.缺血前丰富环境预处理产生的神经保护作用可能与调节内质网应激介导的PERK-ATF4-CHOP通路和IRE1-JNK通路进而抑制自噬和凋亡有关。