研究背景近年来,糖尿病的患病率在全球范围内迅速升高,糖尿病心血管并发症是导致糖尿病患者死亡的最主要原因。糖尿病会导致心肌细胞代谢失调、细胞内钙离子超载、心肌壁内微血管病变等,进而引发心肌细胞肥大、凋亡和心肌纤维化导致心室重构的发生。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者所特有的一种心脏功能障碍,往往会出现左室舒张功能受损,伴或不伴有左室收缩功能障碍,其主要病理改变是左室扩大、心肌间质纤维化、心肌细胞肥大以及心肌细胞凋亡等。DCM的分子机制复杂,其关键调控机制不明,阻碍了有效治疗药物的开发。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在心力衰竭发病和进展中起着关键作用,血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blockers,ARB)和醛固酮受体拮抗剂已被证明可改善心脏重构和功能障碍,成为心力衰竭治疗的基石药物。然而,这些经典RAS成员具有较多的限制性。作为锌离子依赖性金属蛋白酶超家族成员之一,解联蛋白和金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease protein-17,ADAM17)是一种由824个氨基酸组成的跨膜蛋白,其功能是通过蛋白水解作用裂解锚定于细胞膜上的多种细胞因子、细胞粘附因子、生长因子、受体、配体和蛋白酶,进而调节多种细胞功能。近年来研究发现,ADAM17可以裂解细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2),被裂解的ACE2胞外域仍具有ACE2酶活性,ADAM17的金属蛋白酶区对于ACE2的脱落起到主要作用。研究表明,心衰患者血清中的可溶性ACE2水平和活性显著增加,与心衰程度密切相关,其机制可能涉及RAS激活诱导的ADAM17活性升高,从而促进ADAM17对底物ACE2的剪切,使其从细胞膜脱落进入外周血液。然而,ADAM17与DCM的因果关系及分子机制的研究甚少。迄今为止,尚无文献报道ADAM17基因修饰对DCM的影响和分子机制。我们前期的研究发现,心肌细胞特异性敲除ADAM17能够改善DCM小鼠的心肌纤维化、心肌细胞凋亡以及左室功能。这一初步的研究揭示了 ADAM17在DCM小鼠中的有益作用,但其具体机制仍未完全阐明,下列重点科学问题仍悬而未决:(1)ADAM17在心肌不同细胞中的表达和功能不明,ADAM17敲除后细胞凋亡定位于何种细胞仍不清楚;(2)在动物表型的研究中,前期研究的一个重要缺陷是缺少ADAM17α-MHCKO非糖尿病组(即ADAM17α-MHCKO Control组)的对照组,单纯心肌细胞敲除ADAM17基因对小鼠左室形态和功能的影响不明;(3)ADAM17对底物ACE2及其下游产物Ang Ⅱ和Ang-(1-7)作用不明,无法判断ADAM17敲除是否通过ACE2增加而发挥改善DCM的作用;(4)前期研究中使用的是未分化的H9c2细胞系,不具有心肌细胞oral bioavailability的表型特征,不能代表原代心肌细胞,采用分化的H9c2细胞和原代心肌细胞有何差别仍不清楚;(5)ADAM17与糖代谢的关系不明,糖尿病状态下通过何种途径影响ADAM17不明,AMPK是糖代谢的关键调控分子,但ADAM17与AMPK的关系并不清楚;(6)前期研究已知糖尿病状态下ADAM17可影响心肌细胞的自噬和凋亡,但具体调节机制不明,心肌细胞自噬和凋亡之间的因果关系不明。针对以上诸多科学问题,我们设计并进行了一系列体内和体外实验。此外,ACE2在心肌细胞特异性敲除ADAM17改善DCM的疗效中发挥了什么样的作用?当ACE2被干扰时ADAM17对心肌细胞凋亡和自噬的作用是否会消失?为了阐明这些重要的科学问题,我们在体内和体外实验中构建了ADAM17和ACE2基因双干扰的动物和细胞模型,进行了更加深入的探讨。论文Ⅰ ADAM17基因干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的1.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对糖尿病小鼠左室重构和心功能的影响。2.探讨糖尿病小鼠中ADAM17的表达和酶活性升高原因。3.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17如何调控AMPK信号通路。4.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对自噬流的影响以及影响自噬流的具体环节。5.探讨体外实验中ADAM17干扰在原代心肌细胞中的分子机制。研究方法1.敲基因小鼠的构建心肌细胞ADAM17基因特异性敲除小鼠采用CRISPR-Cas9技术构建,通过ADAM1 7flox/flox小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交后获得。将同窝出生的Cre阴性小鼠小鼠作为对照组小鼠。2.动物实验的分组动物实验中共分为四个组.:ADAM17fl/fl Control 组、ADAM17α-MHCKO Control组、ADAM17fl/fl DM组、ADAM17α-MHCKO DM组。3.小动物超声检测小鼠心功能Ⅱ型糖尿病小鼠造模成功后,进行小鼠超声测量评价小鼠的左心室收缩和舒张功能。4.小鼠组织标本取材及病理检查小鼠安乐死后留取心脏等标本放入4%多聚甲醛或负80度冰箱用于后续的病理学和分子生物学实验。对心脏组织切片进行HE、Masson染色、免疫荧光染色以及TUNEL和心肌细胞荧光共定位染色等。5.新生大鼠原代心肌细胞(NRCMs)的提取和H9c2细胞的分化选择新出生的Wistar大鼠乳鼠(1d-3d)利用差速贴壁法提取原代心肌细胞,H9c2细胞用低血清培养加RA刺激促使其向成熟心肌细胞的表型分化。6.细胞实验的分组细胞实验的分组如下:(1)Vehicle组;(2)高葡萄糖/棕榈酸组(GP组);(3)高葡萄糖/棕榈酸+无意义小干扰RNA组(GP+NC-siRNA组);(4)高葡萄糖/棕榈酸+ADAM17小干扰RNA组(GP+ADAM17-siRNA组)。此外,为了探索ADAM17影响自噬流的具体环节,在上述4个组中分别加入CQ及其空白溶剂对照,共分为8个组,分别是:Vehicle组、Vehicle+CQ组、GP组、GP+CQ组、GP+NC-siRNA 组、GP+NC-siRNA+CQ 组、GP+ADAM17-siRNA 组、GP+ADAM17-siRNA+CQ 组。7.RFP-GFP-LC3B自噬流检测使用Premo自噬流检测试剂RFP-GFP-LC3B检测细胞自噬不同阶段的动态过程。8.mRNA测序分析将ADAM17α-MHCKO DM组和ADAM17fl/fl DM组小鼠的心脏组织进行测序。9.Western Blot 实验对动物心脏组织和细胞进行蛋白提取后进行SDS-凝胶电泳,经过转膜、封闭、孵育一抗和二抗后进行发光显影。10.数据统计分析所有数据在分析前先进行正态分布检验,对于符合正态分布的数据,两组之间差异的比较采用非配对t检验。对于连续变量采用平均值±标准误(SEM)的方式表示。在所有的统计分析中,p<0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.糖尿病小鼠的心脏中ADAM17表达显著增加与对照组相比,DCM组心脏中ADAM17 mRNA水平和蛋白表达水平显著增高,ADAM17的酶活性显著增加。2.ADAM17在心脏中的表达分布情况ADAM17在心肌细胞中大量表达,在心肌成纤维细胞和内皮细胞中表达较少,此外与对照组小鼠相比,DCM组小鼠心脏心肌细胞中ADAM17的表达更多。3.各组小鼠的体重、血糖和血脂情况心肌细胞特异性敲除ADAM17基因不影响小鼠的体重、血糖、血脂水平以及葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。4.心肌细胞特异性敲除ADAM17显著改善糖尿病小鼠心室重构和功能心肌细胞特异性敲除ADAM17基因显著改善了糖尿病小鼠的左室重构以及收缩和舒张功能,单纯心肌细胞ADAM17基因敲除不影响生理状态下小鼠的左室重构和功能。5.心肌细胞ADAM17缺乏显著改善心肌纤维化和心肌细胞凋亡Masson结果显示,心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病导致小鼠的心肌纤维化情况,而单纯心肌细胞ADAM17基因敲除不影响生理状态下小鼠的心肌纤维化。TUNEL染色与WB结果显示,心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病小鼠心肌细胞凋亡情况,但不影响生理状态下小鼠心肌细胞的凋亡。在体外实验中得到了与体内实验一致的结果。6.体内和体外实验中ADAM17的作用与其裂解ACE2密切相关ACE2蛋白表达与mRNA表达的解偶联现象表明,在DCM的进程中ADAM17可能仅影响ACE2的转录后表达水平。小鼠血清中ACE2、Ang Ⅱ和Ang-(1-selleck AZD22817)水平的检测结果显示,在生理和病理状态下ADAM17均在调节ACE2-AngⅡ/Ang-(1-7)轴中发挥着关键作用。在体外实验中得到了与体内实验一致的结果。7.ADAM17在调节心肌细胞中AMPK/mTOR信号通路和TFEB表达发挥着重要作用WB结果显示,ADAM17基因敲除可逆转糖尿病所导致的AMPK通路失活和TFEB蛋白表达的抑制。体外实验得到了与体内实验一致的结论。此外,在心肌细胞中GP刺激抑制了 TFEB的核转位,而心肌细胞中抑制ADAM17基因能够显著增强TFEB的核转位。ADAM17通过调节4EBP1和p70S6K蛋白磷酸化影响了 AMPK/mTOR信号通路diABZI STING agonist核磁。8.心肌细胞特异性敲除ADAM17显著改善心肌细胞的自噬流利用自噬抑制剂CQ和自噬双标腺病毒RFP-GFP-LC3B来测量自噬流,结果显示,GP刺激抑制了心肌细胞的自噬通量,心肌细胞中ADAM17的缺乏能够改善细胞的自噬通量。ADAM17可能是在自噬通量的早期通过减弱自噬小体的形成来抑制自噬通量,而心肌细胞中ADAM17缺乏可改善细胞的自噬通量。9.ADAM17缺乏对自噬小体形成过程中相关蛋白表达的影响通过检测Atg3、Atg5、Atg7、Atg12和Beclin-1的蛋白表达水平,发现ADAM17在自噬小体的形成过程中发挥着重要作用,心肌细胞中ADAM17缺乏可促进自噬流中自噬小体的形成。10.ADAM17缺乏通过改善心肌细胞的自噬流减少了凋亡反应在NRCMs细胞中,ADAM17的缺乏通过改善心肌细胞的自噬流减少了凋亡反应。11.ADAM17对ADRA1A/AMPK介导的心肌细胞自噬和凋亡的影响应用选择性AMPK抑制剂Dorsomorphin后检测细胞的自噬和凋亡水平。结果表明,心肌细胞中ADAM17的缺乏通过AMPK改善心肌细胞的自噬和凋亡,当AMPK被抑制时ADAM17的缺乏对细胞自噬和凋亡的改善作用也随之消失。12.HIF-1α可能是糖尿病小鼠中ADAM17上调的上游介质HIF-1α可能是介导糖尿病小鼠ADAM17上调的上游分子,这也解释了糖尿病小鼠心脏中ADAM17蛋白表达和活性升高的可能原因。实验结论1.心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡和心肌纤维化,并改善左室重构和功能障碍。2.在Ⅱ型糖尿病小鼠心脏组织中,HIF-1α的激活上调了 ADAM17的蛋白表达和活性,进而导致心肌组织ACE2蛋白水平显著降低,血清中可溶性ACE2含量显著升高。3.心肌细胞ADAM17敲除通过ADRA1A激活了 AMPK信号通路。4.心肌细胞ADAM17敲除促进自噬流中自噬小体的形成,改善自噬流,进而减少心肌细胞的凋亡。论文Ⅱ ADAM17和ACE2基因单独和合并干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的1.探讨ADAM17缺乏是否通过ACE2发挥其改善糖尿病小鼠心室重构和心功能的作用。2.探讨当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除是否能继续改善糖尿病小鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡。3.探讨体外实验中当ADAM17和ACE2同时被抑制时心肌细胞自噬和凋亡的情况。研究方法1.动物实验的分组小鼠经过配繁后获得ADAM17α-MHCKO小鼠,将同窝出生的Cre阴性小鼠(ADAM17fl/fl小鼠)用于动物实验中的对照组。给予ADAM17fl/fl小鼠和ADAM17α-MHCKO小鼠尾静脉注射心肌细胞特异性启动子cTnT驱动的特异性敲减ACE2的九型腺相关病毒(AAV9-cTnT-shACE2)。动物实验分为4个组:ADAM17fl/fl DM+Vector组、ADAM17α-MHCKO DM+Vector 组、ADAM17fl/fl DM+AAV9-shACE2 组、ADAM17α-MHCKO DM+AAV9-shACE2 组。2.小动物超声检测小鼠心功能同论文Ⅰ部分3.小鼠组织标本取材及病理检查同论文Ⅰ部分4.新生大鼠原代心肌细胞(NRCMs)的提取选择新出生的Wistar大鼠乳鼠(1d-3d)利用差速贴壁法提取原代心肌细胞。5.细胞实验的分组按照实验的设计,细胞实验的分组情况如下:(1)Vehicle组;(2)GP组;(3)GP+NC-siRNA 组;(4)GP+ADAM17-siRNA 组;(5)GP+ACE2-siRNA 组;(6)GP+ADAM17-siRNA+ACE2-siRNA 组。6.Western Blot 实验对动物心脏组织和细胞进行蛋白提取后进行SDS-凝胶电泳,经过转膜、封闭、孵育一抗和二抗后进行发光显影。7.数据统计分析同论文Ⅰ部分。研究结果1.各组小鼠的体重、血糖和血脂情况心肌细胞特异性敲除ADAM17基因以及心脏组织ACE2敲减并不影响糖尿病小鼠的BW、FBG、TG和TC水平。2.ACE2在ADAM17敲除改善小鼠心室重构和心功能中发挥关键作用结果表明,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠左室重构以及左室收缩和舒张功能,说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥了改善糖尿病小鼠左室重构和功能的作用。3.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌纤维化中发挥关键作用Masson结果显示,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的心肌纤维化,说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其抗糖尿病小鼠心肌纤维化的作用。4.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌细胞凋亡中发挥关键作用TUNEL与WB实验结果显示,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡,说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其改善糖尿病小鼠心肌细胞凋亡的作用。5.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌细胞自噬中的作用ACE2在ADAM17通过AMPK通路改善心肌细胞自噬的效应中发挥了关键作用,ADAM17缺乏是通过ACE2发挥了改善心肌细胞自噬的作用。实验结论1.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其改善左室重构和功能的作用,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的左室重构和功能。2.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥改善糖尿病小鼠心肌纤维化和细胞凋亡的作用。3.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥改善糖尿病小鼠心肌细胞自噬的作用。