【研究背景及目的】脓毒症是指对感染反应失调导致的器官功能障碍综合症,其致病机制重点不仅是全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),更是免疫系统调控紊乱,即由初始的过度免疫激活发展至后期广泛的免疫抑制~([1,2])。根据最新的脓毒症流行病学调查,全球每年脓毒症患者约5000万,其中超过1100万患者发生死亡,病死率超过20%,存活的患者中约有半数存在脓毒症后遗症~([3])。免疫系统调控紊乱是脓毒症发生的关键机制之一。病原体入侵机体后被机体固有免疫系统识别,产生先天性免疫应答;然而过度激活的炎症反应会导致血管内皮细胞损伤、白细胞浸润、免疫细胞募集、凝血系统活化、凝血相关因子快速消耗等一系列病理生理改变,导致多器官功能障碍(Multiple organ dysfunction,MODS),甚至死亡~([4,5])。随着抗生素和免疫抑制剂的大量使用,多数脓毒症患者可以从早期的过度炎症反应存活下来,进展为免疫抑制阶段。因此,改善脓毒症的免疫功能是一个新的研究方向。结合我们前期的研究成果,我们考虑白细胞介素6受体(Interleukin-6 receptor,IL-6R)抗体的疗效可能与抗体使用时机体的免疫状态有关。在脓毒症早期,机体处于免疫增强阶段时,使用IL-6R抗体可以减轻细胞因子风暴,改善预后。在机体处于免疫抑制阶段则加重继发性感染。IL-6R抗体疗效的异质性可能与其在脓毒症不同免疫状态下对适应性免疫细胞(主要为巨噬细胞、淋巴细胞)的作用机制不同有关,我们拟通过研究脓毒症不同免疫状GSKJ4溶解度态下IL-6R抗体对淋巴细胞的调控作用,探索IL-6R抗体在脓毒症临床治疗的使用时机,为脓毒症靶向治疗提供参考依据。【方法】1.收集3例脓毒症患者和3例健康人的外周血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)并进行单细胞测序数据整合分析,通过统一流形逼近与投影(Uniform Manifold Approximation and Projection for dimension reduction,UMAP)算法、基因集变异分析(Gene set variation analysis,GSVA)、基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)、细胞拟时分析等方法,比较脓毒症患者与健康人PBMC的差异,分析出脓毒症早期免疫系统紊乱的规律。2.用盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and perforation,CLP)构建脓毒症小鼠模型,观察建模后小鼠的生命体征、形态、体重等变化。将小鼠分为IL-6KO小鼠组、WT小鼠组,CLP后采用临床疾病评分(Clinical disease score,CDS)和脓毒症小鼠评分(Murine sepsis score,MSS)系统进行评分;用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测两组的血清、肺泡灌洗液炎症因子白细胞介素www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等的水平;用免疫荧光染色(Immunofluorescent staining,IFC)、原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated d UTP Nick End Labeling,TUNEL)染色观察器官、免疫细胞的变化情况。验证IL-6R抗体托珠单抗(Tocilizumab,TCZ)对脓毒症小鼠的治疗效果:根据尾静脉注射TCZ时间的不同将小鼠分为假手术组、CLP组和TCZ0+CLP组、TCZ1+CLP组和TCZ2+CLP组,通过观察小鼠72小时的生存率、临床疾病评分以及小鼠脓毒症评分。CLP成功建模后,IL-6KO小鼠和使用TCZ抗体后的小鼠处死后提取脾脏淋巴细胞,用流式细胞术检测淋巴细胞的凋亡情况。3.使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞,检测不同时间点炎性因子m RNA表达水平。用IL-6R si RNA转染RAW264.7细胞,并用LPS刺激转然后的细胞,用ELISA检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平;用流式细胞术检测巨噬细胞的极化水平;用小鼠脾脏淋巴细胞提取试剂盒提取小鼠脾脏淋巴细胞,用LPS刺激Raw264.7细胞,与淋巴细胞共培养,用CCK8法检测淋巴细胞增殖情况;用ELISA试剂盒检测细胞上Bio-controlling agent清液的炎症因子分泌情况,用流式细胞术和Western blot技术检测淋巴细胞的凋亡情况。【结果】1.所有细胞簇共分为14个簇,脓毒症患者PBMC中CD8+T细胞和B细胞比例明显增加,单核细胞、CD4+T细胞比例显著减少。炎症因子介导、免疫反应的调控、对IFN-γ的反应对CD14单核细胞的调控起着重要作用。CD14、CD16单核细胞还参与了凋亡过程的正向调节,IL-6在脓毒症早期的发病过程中起着重要的作用。两组中不同免疫细胞的数量分布显示。调控T细胞的许多上调基因参与了TLR信号通路,并与原始免疫反应有关。而许多下调的基因参与了c AMP信号通路的传导,该通路与T细胞受体介导的免疫激活相关。单核细胞和T细胞之间呈正相关联系。识别特定细胞群中健康组与脓毒症组之间的信号变化,结果发现在CD14和CD16单核细胞群中主要是RESISTIN信号发生巨大变化,推测此信号在脓毒症的发病过程中起着重要的作用。2.用CLP构建脓毒症小鼠模型,首先观察IL-6KO小鼠、WT小鼠CLP后存活情况、炎症因子表达水平、脏器(尤其是肺脏)损伤和细胞凋亡情况。结果显示:完全敲除IL-6会降低脓毒症小鼠的存活率,会加重脓毒症小鼠的脏器损伤,会加重炎症引起的细胞因子风暴。我们推断IL-6在脓毒症早期参与病原体的清除,完全缺乏IL-6会导致病原体无法有效清除,会加重炎症反应和脏器损伤。随后我们对脓毒症小鼠不同时间点注射TCZ,观察小鼠的存活情况和脏器损伤情况。结果显示:在脓毒症早期使用IL-6R抗体提高了脓毒症小鼠的存活率,减轻了脓毒症小鼠的脏器损伤。3.用IL-6R si RNA转染巨噬细胞,观察转染前后炎性因子和巨噬细胞极化特异性标记物的变化情况,发现IL-6R si RNA可以减轻炎症反应促进M2型巨噬细胞极化。用IL-6R si RNA转染巨噬细胞,将巨噬细胞和淋巴细胞共培养,检测细胞上清液和淋巴细胞的炎症因子表达和凋亡情况,发现IL-6R si RNA可以减轻淋巴细胞炎症反应并减少淋巴细胞凋亡。【结论】脓毒症早期T细胞、B细胞和CD14单核细胞数量减少,可能由于细胞凋亡引起的。炎症因子介导、免疫反应的调控、对IFN-γ的反应对CD14单核细胞的调控起着重要作用。单核细胞和T细胞之间呈正相关联系。IL-6-JAK-STAT3信号通路在单核细胞中激活,表明IL-6在脓毒症早期的发病过程中起着重要的作用。完全敲除IL-6后,机体无法有效清除入侵的病原体,炎症反应更加明显,脏器损伤更加严重。在脓毒症早期尽快使用IL-6R抗体TCZ可以有效减轻炎症反应,促使巨噬细胞向M2型转化并减少淋巴细胞凋亡。