背景心肌梗死是危害人类身心健康的严重心血管疾病,再灌注治疗技术的发展与成熟以及基础设施的建立健全,极大的降低了心肌梗死的死亡率同时改善了患者预后,但是缺血事件导致的慢性心力衰竭影响着越来越多的患者。研究表明,心梗后心肌纤维化在慢性心力衰竭进展中起重要作用,心肌纤维化的程度与心力衰竭患者死亡率和住院率增加密切相关。因此,抑制心肌纤维化在治疗心力衰竭方面具有重要意义。胶原蛋白在细胞外基质中的过度沉积是纤维化的主要标志,研究胶原蛋白参与心肌纤维化的过程在治疗心脏疾病方面具有重要意义。Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是纤维化中主要的胶原蛋白,目前研究主要集中在胶原mRNA的转录水平上,在转录后研究较少。胶原蛋白的生物合成是一个复杂的过程,需要在内质网内进行多次共翻译转运和翻译后修饰。其中,赖氨酸修饰是在细胞内外发生的高度调控的顺序过程,螺旋结构域中的特定羟赖氨酸残基随着半乳糖或葡萄糖的加入而进行糖基化。胶原β(1-O)半乳糖基转移酶25域1(GLT25D1)是胶原糖基化的关键胶原糖基转移酶,通过催化β-半乳糖基转移到胶原蛋白的羟赖氨酸(Hyl)残基上,从而在其翻译后修饰过程中启动胶原蛋白糖基化。然而,它在心梗后心肌纤维化中的作用仍不明确,特别是在心脏成纤维细胞中。心脏成纤维细胞是与心肌纤维化相关的主要胶原生成细胞。目的本研究旨在阐明GLT25D1在心肌梗死后心肌纤维化中的作用及部分可能的作用机制,以期寻找改善或治疗心肌梗死后心肌纤维化的药物靶点。方法1.通过建立小鼠心肌梗死模型,观察小鼠存活情况绘制生存曲线分析生存时间的差异。2.通过建立小鼠心梗模型,在术后第14天通过小动物心脏超声评估小鼠心功能情况后取材。采用HE染色观察组织细胞形态结构变化;采用Masson染色观察组织中胶原纤维分布情况评估纤维化程度;采用免疫组织化学染色方法对血管内皮标志物CD31进行染色观察微血管密度评估新生血管情况;采用WGA荧光染色显示心肌细胞膜判断心肌细胞肥大情况。3.提取心肌梗死14天后的小鼠心脏梗边区组织蛋白质,采用4D Label-free定量蛋白质组学技术进行心肌梗死后14天差异表达蛋白质Small biopsy(DEPs)的检测及筛选。通过生物信息学技术对DEPs的生物学功能进行初步分析,整理GO分析中与纤维化相关的条目筛选目标蛋白质。4.在组织水平上,采用免疫组织化学方法对Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白进行染色评估胶原蛋白沉积情况;采用Western Blot实验检测小鼠心脏组织中α-SMA、Col 1、Col 3及FN纤维化标志物表达水平;并采用Western Blot验证GLT25D1在心梗小鼠心脏组织中的差异表达情况。5.从新生1-3天日龄的C57BL/6乳鼠心脏中利用Ⅰ型胶原酶消化及差速贴壁的方法分离提取小鼠乳鼠原代心脏成纤维细胞,采用细胞免疫荧光的方法对其标志物Vimentin进行染色以鉴定其纯度。6.设计合适的GLT25D1小干扰RNA(si-GLT25D1),用100 nM的终浓度转染原代心脏成纤维细胞48 h,RSL3通过qRT-PCR检测siRNA对GLT25D1的沉默效率,并通过Western Blot检测siRNA对GLT25D1表达的抑制效果。7.si-GLT25D1转染原代心脏成纤维细胞后,Western Blot检测α-SMA、Col 1、Col 3、FN纤维化标志物及TGF-β1、Smad 3和p-Smad 3表达水平。8.4-6周的雄性C57BL/6小鼠尾静脉注射过表达GLT25D1的AAV9病毒载体(AAV9-GLT25D1),4周后行超声心动图检查后避光取材制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP,Western Blot检测GLT25D1的过表达效果。9.尾静脉注射AAV9-GLT25D1 4周后建立小鼠心肌梗死模型,术后第14天行小鼠心脏超声检查检测小鼠心功能改变。采用HE染色观察组织细胞形态结构变化;采用Masson染色观察组织中胶原纤维分布情况评估纤维化程度;此外,通过Western Blot检测Col 1、Col 3表达水平。结果1.MI组小鼠在术后第1天、第3天和第5天共死亡5例,死亡原因主要为心脏破裂、呼吸道梗阻和胸腔积血。连续跟踪42天后,Sham组存活10只,MI组7只,Log-Rank检验得到P=0.0251。2.超声结果显示与Sham组相比,MI组小鼠的心功能指标EF、FS均下降,心腔内径LVIDs及LVIDd均显著增加,左心室前壁厚度变薄,差异均具有统计学意义;HE染色镜下观察可见Sham组组织切片中心肌细胞排列规则,而MI组有大量心肌细胞坏死,炎性细胞浸润,心肌间质纤维增生,肌纤维走向紊乱;Masson染色显示MI组有明显胶原纤维沉积,纤维化程度增加;此外,抗CD31抗体免疫组化结果显示与Sham组selleck激酶抑制剂相比,MI组新生毛细血管增多;WGA荧光染色结果表明与Sham组比较,MI组中非梗死区心肌细胞横截面积增加。3.4D Label-free定量蛋白质组学筛选出心梗后心脏重构中梗边区DEPs共1053个,其中609个为上调的DEPs。从GO富集分析中筛选出与纤维化相关的条目富集得到77个纤维化相关的蛋白质,GLT25D1是其中尚未被研究过的可能参与心肌纤维化的蛋白质。4.与Sham组相比,MI组小鼠心脏组织病理切片免疫组织化学结果显示Col1和Col 3阳性程度显著增加,并且Western Blot结果显示MI组小鼠心脏中纤维化标志物蛋白水平较Sham组均显著升高。此外,GLT25D1在MI组小鼠心脏梗边区中表达明显升高。5.si-GLT25D1转染原代心脏成纤维细胞48 h后,qRT–PCR及Western Blot结果显示si-GLT25D1组中GLT25D1的mRNA和蛋白表达均显著下降。6.si-GLT25D1转染原代心脏成纤维细胞48 h后,与si-NC组相比,si-GLT25D1组中α-SMA、Col 1、Col 3、FN纤维化标志物蛋白表达水平均下降。并且,沉默GLT25D1后TGF-β1、p-Smad 3/Smad 3显著降低。7.尾静脉注射AAV9-GLT25D1 4周后行超声心动图检查,结果显示在生理状态下过表达GLT25D1对小鼠心脏功能无明显影响,Western Blot结果显示与生理盐水组及AAV9-Vector组相比,AAV9-GLT25D1组中GLT25D1表达显著升高,提示在体过表达成功。8.在体过表达GLT25D1后行心肌梗死造模手术,14天后超声心动图结果显示与MI+AAV9-Vector组相比,MI+AAV9-GLT25D1组进一步加重小鼠心功能损害,其左室射血分数EF及缩短分数FS均显著下降。与MI+AAV9-Vector组相比,GLT25D1过表达的小鼠心脏组织中Col 1和Col 3显著升高。HE染色和Masson染色显示,AAV9-GLT25D1组的小鼠心肌纤维化显著增加。结论GLT25D1在心梗后心肌纤维化中表达升高,抑制GLT25D1可以影响心脏成纤维细胞活化。其机制可能是GLT25D1通过TGF-β1/Smad 3信号通路参与心肌梗死后心肌纤维化。