研究目的:糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病,同时当人体长期处于高血糖状态时又会引发一系列的慢性损伤和机能障碍。骨骼肌是一种代谢活跃的器官,约占人体总体重的40%,同时也是调节机体糖代谢的重要器官,对于维持机体的血糖平衡和稳定起着重要作用。正常生理条件下,机体80%的葡萄糖是由骨骼肌所摄取并利用,而反过来糖尿病患者的骨骼肌的葡萄糖摄入降低又会导致机体出现高血糖状态。运动训练在骨骼肌中会引发高度协调的适配影响,不仅可以满足机体长期的身体和代谢需求,还可以对其他组织/器官产生多种保护作用,对整体健康和疾病预防具有长期益处。肌肉萎缩是糖尿病较为常见的并发症之一,机体主要表现为肌肉质量下降,体积减小等。机体长期处于高血糖状态时会导致骨骼肌肌纤维结构和类型发生改变。有研究表明,糖尿病小鼠会表现出肌纤维束变窄,肌纤维间隙变大,间质增生,出现肌肉萎缩症状。但目前运动对于糖尿病引起的肌肉萎缩的影响及其作用机制仍未被完全阐明。运动干预是否能够减轻糖尿病肌肉萎缩,进而促进其愈合和葡萄糖摄取利用的能力?本研究以成肌细胞C2C12为对象,从形态学,生理生化,蛋白和基因等不同层面上研究机械牵拉对于糖尿病受损肌细胞功能的改善作用,以寻找一种对糖尿病萎缩肌肉相对安全有效的运动强度,及揭示运动改善糖尿病肌萎缩的机制。研究方法:第一阶段,使用不同牵拉强度的周期性机械牵拉细胞模拟机体体外运动模式作用于成肌细胞,筛选最有效的改善糖尿病受损成肌细胞的参数。将C2C12小鼠成肌细胞直接接种于机械牵拉专用的细胞应变片上Ferrostatin-1作用,待其充分贴壁,使用DMEM基础培养基+10%FBS胎牛血清的培养液浸没装有细胞应变片的无菌培养皿,待细胞密度达到70%时开始进行牵拉干预。牵拉组分别采取1000μstrain,1200μstrain,1400μstrain三种不同机械牵拉强度,每天1 h,共持续5天。之后通过CCK8检测各组成肌细胞GSK1120212细胞培养的增殖效果,通过葡萄糖氧化酶法(GOD)培养液上清葡萄糖含量检测各组的成肌细胞摄取葡萄糖的能力。第二阶段应用1200μstrain的牵拉强度干预糖尿病受损成肌细胞,验证机械牵拉对糖尿病受损成肌细胞功能的改善效果。将C2C12小鼠成肌细胞分为正常对照组(NC),糖尿病模型组(PA),糖尿病模型牵拉组(PA+MS),糖尿病模型组使用0.5mM棕榈酸溶液诱导干预24h构建糖尿病受损成肌细胞模型。PA+MS组使用1200μstrain的机械牵拉强度干预糖尿病模型组细胞1h,共持续5天。通过CCK8和DIPA染色检测各组细胞的增殖能力,划痕实验检测各组成肌细胞愈合能力,GOD培养液上清葡萄糖含量检测各组成肌细胞摄取葡萄糖的能力,PAS染色试剂盒检测各组细胞利用葡萄糖合成糖原的能力。Western Blotting方法检测胰岛素通路重要分子葡萄糖转运蛋白4(Glut4)的蛋白表达。使用1.5ml离心管收集孔板上清液,1000 r*3 min离心,弃去沉淀只留上清液,每孔中加入100μl的GOD混合液,37℃孵育箱中静置30 min,使用酶标仪在450 mm条件下检测各组细胞上清葡萄糖吸光度,代入试剂盒相关公式计算每孔细胞的葡萄糖含量。运动干预5天后的各组细胞,提取上清后,用PBS清洗三次细胞孔,每孔中加入CCK8试剂(CCK8:DMEM培养液=1:10),37℃孵育箱中静置30 min,将孔板中的CCK8混合液转移至无菌96孔板中,每孔加入100μl的CCK8混合液,每组各做3个副孔对照,使用酶标仪在450mm条件下检测细胞吸光度OD值。研究结果:使用不同的机械牵拉强度去干预C2C12细胞,结果显示,与NC组相比,不同强度牵拉Transiliac bone biopsy组细胞的摄取糖分能力均有所上升(p<0.01),同时细胞增殖能力增强(p<0.01),去除细胞增殖因素外,细胞摄取葡萄糖的能力也均显著上升(p<0.01),其中1200μstrain组的成肌细胞增殖和摄取葡萄糖能力的效果最佳。棕榈酸溶液诱导干预24h后,PA组与NC组相比,成肌细胞摄取葡萄糖的能力显著下降(p<0.01),同时细胞增殖能力显著降低(p<0.01),迁移能力显著减弱(p<0.01), PAS糖原染色结果显示NC组细胞中有较多的糖原沉积(p<0.05),与此同时去除细胞增殖因素外,模型组细胞摄取糖分的能力也显著下降(p<0.01),GLUT4的蛋白表达显著下降(p<0.05),以上实验综合验证了棕榈酸诱导糖尿病受损成肌细胞模型构建成功;PA+MS组与PA组相比,细胞摄取葡萄糖的能力显著上升(p<0.01),同时细胞增殖能力显著上升(p<0.01),去除细胞增殖因素外,细胞摄取葡萄糖的能力也显著上升(p<0.01),迁移能力显著增强(p<0.01),GLUT4的蛋白表达显著上调(p<0.05)。研究结论:不同强度的机械牵拉均可有效促进肌细胞的增殖,其中1200μstrain的效果最佳。1200μstrain的牵拉强度可以有效改善糖尿病受损细胞增殖、迁移及对葡萄糖的吸收和利用能力。