我国是世界上最大的猪肉生产国和消费国,生猪饲养量和猪肉消费量约占世界总量的50%。随着人们生活水平的提高,对肉品质的要求也逐渐提高。因此,提高猪肉的品质,明确影响肉质的分子机制引起了研究关注。肌纤维类型的组成决定了肌肉组织的整体生化和功能SCH772984核磁特性,进而决定了鲜肉的质量。本团队前期对猪快慢肌纤维进行高通量测序,筛选并初步验证了circMYLK4可作为猪骨骼肌快/慢肌纤维的新型调节因子。因此,明确circMYLK4的分子机制对提高猪肉的质量具有重要意义。本研究通过转录组、蛋白组、磷酸化蛋白组和能量代谢组联合分析明确了circMYLK4在肌肉发育中的功能,并在猪骨骼肌卫星细胞中利用分子生物学技术证明了circMYLK4对肌细胞代谢的影响。进一步通过多聚体分析、双荧光素酶报告实验、RNA pull-down及RIP等方法阐明了circMYLK4的作用机制。最后在小鼠骨骼肌中外源注射circMYLK4-AAV明确circMYLK4功能的保守性。获得了以下主要结果:1.ciResearch Animals & AccessoriesrcMYLK4抑制猪骨骼肌糖酵解过程,促进氧化磷酸化过程。利用转录组、蛋白组及磷酸化蛋白组联合分析发现,过表达circMYLK4后上调基因主要富集到脂肪酸代谢,下调基因主要富集到糖酵解等过程。进一步分析发现circMYLK4不影响葡萄糖代谢关键酶HK2的表达,而是抑制糖原分解关键酶PYGM及PGM1的表达,从而抑制糖酵解过程。同时,circMYLK4促进了脂肪酸氧化、TCA循环关键基因以及线粒体电子传递链相关基因的表达。与此一致,能量代谢组发现,糖酵解中间代谢产物显著降低,TCA循环中间代谢产物显著升高。此外,对肌肉收缩相关基因分析发现,慢肌纤维标志基因MYH7、TNNI1、TNNT1及TNNC1的表达升高,快肌纤维标志基因MYH4及TNNT3的表达降低。2.circMYLK4抑制猪肌卫星细胞糖酵解过程,增强线粒体代谢。猪骨骼肌卫星细胞过表达circMYLK4显著抑制糖酵解关键基因的m RNA及蛋白水平(P<0.05),显著降低细胞中的乳酸含量(P<0.05)。进一步发现circMYLK4显著促进了脂肪酸氧化、TCA循环关键基因的m RNA及蛋白水平(P<0.05),显著增加细胞中的琥珀酸含量(P<0.05)。此外,线粒体氧化磷酸化关键基因的m RNA及蛋白水平显著增加(P<0.05),细胞中ATP含量显著上升(P<0.05),线粒体活性增强。3.circMYLK4既不编码多肽也不吸附miRNAs,而是与蛋白CACNA2D2结合。生物信息学发现circMYLK4包含三个ORF,通过多聚体分析发现circMYLK4主要在单组分中富集,表明其不具有编码能力。接下来通过RNA pull-down富集circMYLK4结合的miRNA,通过累积分布曲线及双荧光素酶实验发现富集前四的miRNA均不能与circMYLK4结合,进一步通过AGO2免疫沉淀发现circMYLK4不能与miRNA结合。通过RNA pull-down富集与circMYLK4结合的蛋白质,通过WB及RIP证明了钙离子通道DHPR的辅助亚基CACNA2D2可以与circMYLK4结合。4.CACNA2D2参与circMYLK4调控的钙稳态。猪骨骼肌卫星细胞过表达CACNA2D2显著促进糖酵解及线粒体氧化磷酸化过程。MitoTracker染色、线粒体拷贝数及细胞内ATP水平的增加表明CACNA2D2增强了线粒体代谢。深入分析蛋白组中钙信号相关基因发现,circMYLK4抑制了钙释放通道RYR1的蛋白水平,显著降低钙离子结合蛋白PVALB的蛋白水平(P<0.05),显著增加线粒体MCU的蛋白水平(P<0.05)。通过钙离子荧光探针发现circMYLK4降低了细胞质中的钙离子浓度,CACNA2D2可恢复circMYLK4抑制的钙离子浓度(P<0.05)。此外,CACNA2D2可抵消circMYLK4对糖原分解关键酶PHKB及PHKG1的抑制作用(P<0.05)。5.circMYLK4促进小鼠快肌纤维向慢肌纤维转化。通过对circ Atlas 3.0数据库中猪、小鼠和人类MYLK4产生的环状RNA分析发现,该数据库未发现猪MYLK4基因产生的circRNA,进一步发现小鼠mmu-Mylk4＿0004和人类hsa-MYLK4＿0016与circMYLK4序列高度相似,表明circMYLK4是一个新型保守的circRNA。外源circMYLK4-AAV注射小鼠腓肠肌发现,circMYLK4显著增加慢肌标志基因MYH7的蛋白和m RNA水平(P<0.05),显著抑制快肌标志基因MYH4的蛋白和m RNA水平(P<0.05)。H&E及免疫荧光染色表明circMYLK4减小了肌纤维横截面积,增加了慢肌纤维比例。综上所述,selleck抑制剂本研究发现circMYLK4通过与CACNA2D2结合,降低了细胞质中钙离子浓度,从而抑制了糖原分解的关键酶PHK及PYGM的活性,进而使糖酵解过程受到抑制。另一方面,circMYLK4通过促进脂肪酸氧化,增强了三羧酸循环及线粒体氧化磷酸化。此外,本研究还发现circMYLK4高度保守,可促进小鼠快肌纤维向慢肌纤维转化。因此,circMYLK4作为猪骨骼肌快/慢肌纤维的新型调节因子对提高猪肉的质量具有重要意义。