结肠癌(CRC)是全球范围内最常见的消化道癌症之一,在我国CRC的发病率和死亡率正逐年增加。近年来,手术、化疗等抗癌治疗的方法虽然不断改进,但是CRC患者的总生存率和预后却不理想。鉴于肿瘤细胞对化疗药物的耐药性以及化疗药物的毒副作用,CRC的临床治疗效果严重受限。因此,寻找一种安全高效的新型CRC治疗策略显得极为迫切。从天然产物中寻找具有抗癌活性且毒副作用低的有效活性成分是目前研究的热点。葫芦素E(Cucurbitacin E)作为临床药Ipatasertib生产商物“葫芦素片”的重要活性成分,是一种具有广泛药理活性的天然产物,主要包括保肝、抗炎、抗菌、抗肿瘤、治疗心血管疾病以及提高机体免疫力等功效。我们课题组前期研究发现,葫芦素E在诱导肿瘤细胞衰老方面具有很大的潜力。细胞衰老是导致不可逆的细胞周期阻滞的过程,被认为是一种重要的抑制肿瘤的策略。多种内外部因素的影响都可以触发细胞衰老,包括癌基因激活、DNA损伤、端粒功能障碍和细胞应激等。此外,细胞衰老与肿瘤抑制、组织修复、胚胎发生等生物学进程密切相关。最新研究表明,能够特异性消除衰老细胞的遗传模型已经证Ceralasertib明了靶向衰老极具治疗益处。衰老诱导药物导致衰老细胞获得特有的新弱点,这些弱点可以被senolytics选择性地靶向清除。Senolytics是一类能够选择性杀死衰老细胞的药物。Senolytics基于序贯疗法原理,即先诱导肿瘤细胞衰老,再选择性杀死衰老肿瘤细胞,该策略正在积极探究用于抗癌治疗。然而,人们对CE诱导CRC细胞衰老中的分子机制尚不清楚。本课题我们阐明了CE诱导CRC细胞衰老的具体机制,同时利用CE介导CRC细胞衰老的致命弱点,并进一步探索基于序贯疗法靶向清除CE介导衰老CRC细胞的作用机制。本课题研究内容主要包括:1、通过构建的AOM/DSS小鼠结肠癌模型,观察到CE处理组的肿瘤直径和平均瘤数明显小于AOM/DSS诱导组;HE染色与免疫组化分析显示,CE处理后可以抑制结肠癌细胞的增殖,并增强了DNA损伤反应和衰老的指标;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色实验结果显示,CE诱导的CRC细胞衰老可被TFAP4的过表达所回调,敲低TFAP4明显促进了CE介导的CRC细胞衰老;采用mi Rwalk-2数据库分析发现,CE处理CRC细胞明显促进mi R-371b-5p的表达;荧光素酶报告系统结果显示,mi R-371b-5p可明显减弱野生型TFAP4 3′-UTR的荧光素酶活性。这些结果表明,CE处理通过诱导mi R-371b-5p的表达,mi R-371b-5p直接靶向并降解TFAP4。TFAP4的下调是CE介导CRC细胞衰老的关键因素。2、通过细胞转染和q PCR实验在转录水平上检测CRC细胞内衰老相关标志物的变化情况,结果发现,mi R-371b-5p抑制剂可以上调p53、p21、p16的表达。我们提示了CE诱导CRC细胞衰老的具体机制,即CE主要通过调控mi R-371b-5p/TFAP4信号轴诱导CRC细胞衰老。3、SA-β-Gal染色实验结果显示,敲低FBXW7可以触发CRC细胞的衰老,并且白藜芦醇能够清除衰老的CRC细胞;通过FBXW7过表达质粒的构建和SA-β-Gal染色实验,结果发现,过表达FBXW7也可以消除CE诱导的衰老CRC细胞。以上结果表明,通过基于白藜芦醇处理或活化FBXW7的序贯疗法可靶向清除衰老的CRC细胞。综上所述,CE处理通过mi R-371b-5p的高表达直接靶向降解TFAP4,从而诱导CRC细胞衰老;基于白藜芦醇处理或活化FBXW7的序贯疗法可靶向清除由CE诱导的衰老CRC细胞。本课题研究成果不仅揭示了CE诱导CRC细胞衰老的具体机制,也提出了基于白藜芦醇或过表达FBXW7Symbiotic drink的序贯疗法在选择性消除衰老CRC细胞方面的新功效。研究结果,不仅为葫芦素E在CRC中“老药新用”提供新思路和科学依据,也为靶向CRC的临床治疗提供新策略。