研究背景及目的:急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是成人最常见的急性白血病类型,是一种遗传异质性的克隆性造血干细胞恶性肿瘤。2015-2019年期间,AML的死亡率约为每年2.7/10万,五年相对生存率为29.5%。在这种低生存率的情况下,AML患者的治疗选择仍很有限,主要以阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)?联合蒽环类药物强化化疗为主。仍有10-40%的年轻患者对AML诱导治疗无效,而60岁以上患者的这一数字要高得多(40%-60%)。缓解后复发在AML治疗中也是很常见的情况,发生在40%-50%的年轻患者和绝大多数老年患者中。这一类复发难治(Relapsed or Refractory,RR)AML患者的预后通常很差,耐药则是其治愈的主要限制性因素。因此,想要进一步提高AML患者的存活率,则需不断探索治疗的耐药机制。越来越多的证据表明,转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-Pexidartinib使用方法β1)与多种实体肿瘤的化疗耐药有关,如肝细胞癌、结直肠癌和鳞癌等。因此我们推测,复发难治AML患者存在异常的TGF-β1表达,且与化疗耐药相关。研究方法:一、TGF-β1在AML患者中的表达水平以及其信号通路对AML细胞生物学特性和耐药的影响1.TGF-β1在AML患者中的表达水平:收集健康体检者、缺铁性贫血患者以及各疾病状态AML患者外周血及骨髓标本。研究对象分组包括AML组和对照组,其中AML组根据疾病状态不同,划分为初诊组、缓解组和复发难治组;对照组主要为缺铁贫患者(IroFluorescence Polarizationn Deficiency Anemia,IDA)和健康体检者。标本收集后通过密度梯度离心法提取出外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),并提取RNA,再通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)的方法检测PBMC中TGF-β1的m RNA水平;其次,通过酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Elisa)法检测血浆及骨髓液中TGF-β1细胞因子水平,同时,利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)的方法检测骨髓活检标本中TGF-β1表达水平。2.TGF-β1表达水平与AML患者临床参数、治疗反应率及预后的关系:AML初诊和复发难治患者血浆中TGF-β1水平与实验室检查结果、首次治疗后缓解状态进行相关性分析。同时在GEPIA2在线数据库中检测AML患者TGF-β1水平与预后的关系。3.TGF-β1及其信号通路在AML耐药细胞中的表达情况:使用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测AML阿霉素耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和非耐药细胞(HL60和K562)之间TGF-β1、TGF-β信号通路关键蛋白的表达情况;Elisa法检测细胞培养上清中TGF-β1细胞因子的水平。4.TGF-β1对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:在AML细胞(KG-1A,K562和HL60)培养基中加入一定浓度的TGF-β1后,分别通过CCK8法检测增殖、AnnexinⅤ-PI流式法检测凋亡、PI流式法检测周期、衰老相关β半乳糖苷酶(Senescence‐associated‐β‐Galactosidase,SA‐β‐Gal)染色检测衰老细胞比例、Transwell迁移/侵袭实验检测迁移及侵袭能力。5.阻断TGF-β信号通路对AML耐药细胞化疗敏感性的影响:在AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)培养基中加入2种TGF-β受体抑制剂,再用阿霉素(Doxorubicin,DOX)诱导凋亡,48h后用AnnexinⅤ流式法检测凋亡细胞比例。同时,使用WB法检测促凋亡蛋白BAX和Caspase3蛋白的表达水平。二、TGF-β1-SMAD4-SOX4信号轴在AML细胞化疗耐药中的机制研究1.AML患者PBMC中SOX4的表达水平以及与TGF-β1水平的相关性分析:该部分研究的对象及标本处理的方法同TGF-β1,并分析AML患者PBMC中SOX4和TGF-β1表达水平的相关性,同时分析与患者血浆中TGF-β1细胞因子水平的相关性。2.TGF-β1对AML细胞中SOX4表达水平的影响:在AML非耐药细胞(KG-1A和K562)培养基中加入一定浓度的TGF-β1后,使用q PCR法和WB法检测AML细胞株中SOX4表达水平;同时利用2种TGF-β受体抑制剂阻断AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)中TGF-β信号通路,检测SOX4表达水平。3.AML耐药细胞中SOX4表达水平:使用q PCR法和WB法检测AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和非耐药细胞(HL60和K562)中SOX4表达水平差异。4.SOX4对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:使用小干扰RNA(Small Interfering RNA,si RNA)获悉更多干扰AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和非耐药细胞(KG-1A和K562)中SOX4表达,再用阿霉素诱导细胞凋亡,48h后用流式法进行凋亡检测。同时,分别通过CCK8法和AnnexinⅤ-PI流式法检测干扰SOX4表达之后的AML耐药细胞和非耐药细胞的增殖与基础凋亡。5.TGF-β1通过SOX4诱导AML细胞发生耐药:在AML非耐药细胞(KG-1A和K562)培养基中加入TGF-β1后,用si RNA干扰SOX4表达,并用阿霉素作用48h,通过AnnexinⅤ-PI流式法检测凋亡细胞比例。6.SOX4转录因子预测及SMAD4在AML中表达水平:使用JASPAR在线数据库预测SOX4启动子区域可能结合的转录因子;AML患者PBMC中SMAD4水平检测对象及方法同SOX4,并与SOX4水平进行相关性分析。7.TGF-β1通过促进SMAD4核內移调控SOX4的表达:在KG-1A细胞中加入TGF-β1后,用si RNA干扰SMAD4表达,再通过免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)法检测TGF-β1作用下SMAD4细胞核内移的情况;同时使用q PCR法和WB法检测AML细胞中SOX4表达水平。研究结果:一、TGF-β1在AML患者中的表达水平以及其信号通路对AML细胞生物学特性和耐药的影响1.TGF-β1在AML患者中的表达水平:AML复发难治组患者PBMC中TGF-β1 m RNA水平显著高于初诊组及缓解组,但较健康对照低,且具有统计学差异。复发难治组患者血浆中TGF-β1水平显著升高,与初诊组及缓解组均具有统计学差异;骨髓液中,复发难治组TGF-β1水平较初诊组显著升高。在骨髓活检标本中,AML复发难治组患者TGF-β1阳性表达较初诊组明显增加。同一患者血浆和骨髓中TGF-β1水平无显著差异,但存在正相关性,且同一患者PBMC中TGF-β1 m RNA水平和血浆TGF-β1蛋白水平呈正相关。2.TGF-β1表达水平与AML患者临床参数、治疗反应率及预后的关系:初诊组中,血浆TGF-β1水平与血小板计数呈正相关;骨髓液中TGF-β1水平与年龄和血小板呈正相关,而与外周血中原始细胞百分比和骨髓中原始细胞百分比呈负相关。复发难治组中,血浆TGF-β1水平与血小板计数呈负相关,与外周血中原始细胞百分比和骨髓中原始细胞百分比呈正相关;而骨髓液中TGF-β1水平与血小板计数呈负相关,而与外周血中原始细胞百分比和骨髓中原始细胞百分比呈正相关,但无统计学差异。3.TGF-β1及其信号通路相关蛋白在AML耐药细胞中的表达水平:AML耐药细胞中TGF-β1水平较非耐药细胞相比显著升高,同时发现,下游SMAD2和SMAD3磷酸化水平亦显著升高。耐药细胞培养上清中TGF-β1水平均亦较非耐药细胞显著升高,阻断TGF-β信号通路后下游SMAD2磷酸化水平明显下调。4.TGF-β1对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:TGF-β1对AML细胞的增殖、凋亡及周期影响不完全一致,但经过TGF-β1预处理的AML细胞(KG-1A和K562)再经历DOX杀伤后凋亡细胞比例明显减少,同时发现TGF-β1可促进KG-1A、K562衰老和迁移/侵袭能力。5.阻断TGF-β通路对AML耐药细胞化疗敏感性的影响:TGF-β受体抑制剂联合化疗药物(DOX和Ara-C)后对AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)的抑制率较单用化疗药物明显上升,凋亡细胞比例也显著升高。二、TGF-β1-SMAD4-SOX4信号轴在AML细胞化疗耐药中的机制研究1.AML患者PBMC中SOX4的表达水平以及与TGF-β1水平的相关性分析:AML复发难治患者中SOX4表达显著高于初诊组、缓解组以及健康对照组,且与PBMC中TGF-β1水平和血浆中TGF-β1蛋白水平显著正相关。2.TGF-β1对AML细胞SOX4表达水平的影响:在AML细胞(KG-1A和K562)中,随着加入TGF-β1细胞因子浓度的升高,SOX4 m RNA和蛋白水平均逐渐提升。而使用TGF-β受体抑制剂阻断AML耐药细胞(HL60/ADR及K562/ADR)中的TGF-β信号通路,同样发现SOX4蛋白水平下调。3.AML耐药细胞中SOX4表达水平:在AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)中,SOX4表达水平较AML非耐药细胞(HL60、K562)显著升高。4.SOX4对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:干扰SOX4表达可增加AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和AML非耐药细胞(KG-1A和K562)的化疗敏感性。同时可抑制AML耐药细胞的增殖和促进其凋亡;而对AML非耐药细胞的增殖无显著影响,基础凋亡率轻度升高。5.TGF-β1通过SOX4诱导AML细胞耐药:TGF-β1可以促进AML细胞(KG-1A、K562)抵抗DOX诱导的凋亡作用,而干扰SOX4水平后这种抗凋亡作用减弱。同样在化疗药物作用的条件下,干扰SOX4表达后AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)的凋亡比例显著增加。6.SOX4转录因子预测及SMAD4在AML中表达水平:经在线网站预测,TGF-β信号通路中SMAD4可以与SOX4启动子区域结合。SMAD4在AML复发难治组水平较初诊组升高,较健康对照组减低,与缓解组无显著差异。且初诊组SMAD4表达水平与SOX4水平显著正相关。7.TGF-β1通过SMAD4核內移调控SOX4的表达:在AML细胞中,TGF-β1可以引起SMAD4核转移,而在SMAD4被si RNA干扰后,这种核转移现象明显下调,且SOX4在m RNA和蛋白水平的表达也均出现了不同程度的下调。研究结论:1.复发难治AML患者和AML耐药细胞中TGF-β1表达水平显著升高,提示TGF-β1与AML耐药相关。2.TGF-β1可促进AML细胞发生耐药,而TGF-β受体抑制剂可提高耐药细胞的化疗敏感性。3.TGF-β1可能通过TGF-β1-SMAD4-SOX4轴促进AML细胞耐药。