研究背景心脑血管疾病临床表现复杂,死亡率高,疾病负担重。心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后引发卒中、认知功能障碍、抑郁等脑部并发症,大大加重了临床死亡率及治疗难度,其治疗成为一个亟待解决的难题,但是目前对于MI后引起脑部疾病的中间介质及机制尚不清楚。已有研究表明,MI引起炎症反应、氧化应激、自噬等多个病理环节的激活,导致脑部神经炎症反应的发生,且伴随心肌缺血时间的延长,脑部出现持续的神经炎症反应,不仅会引发神经毒性,造成神经元损伤,促进神经退行性疾病的发生,还会使交感神经兴奋性增强,导致恶性心律失常的发生。因此,揭示MI后出现神经炎症反应的病理机制,将为心脑共病的防治提供有效途径。神经炎症反应参与多种神经系统疾病的发病机制,由中枢神经系统内主要的免疫细胞—小胶质细胞驱动。一方面,小胶质细胞参与中枢神经系统发育,包括调节神经突触形成、修剪突触、吞噬和清除因程序性细胞死亡的神经元,帮助维持脑内环境稳定;另一方面,脑部出现损伤时,小胶质细胞发生表型变化,迅速增殖,促进神经炎症反应发生。但是,过度激活的小胶质细胞则会造成持续的神经炎症反应,促进神经退行性疾病等神经系统疾病的发生。因此,小胶质细胞常作为神经系统疾病的主要研究对象,而离子化钙结合适配器分子1(Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1,IBA-1)作为小胶质细胞标记物,被广泛用来研究脑部神经炎症反应。对心脑之间的关系,中医认为,“神明之体藏于脑,神明之用发于心”,元神在脑,识神在心,心脑息息相关。脑之神明伤,累及于心,心之神明伤,累及于脑。在治疗上,中医强调“脑心同治”。脑心通方(胶囊)是“脑心同治”的代表方剂,临床广泛用于缺血性心脑血管疾病Anti-biotic prophylaxis的治疗,疗效可靠。因此,可用于心脑共病的研究。为探究MI后出现神经炎症反应的病理过程及机制,本研究拟利用IBA-1标记MI大鼠脑部的小胶质细胞,检测神经炎症反应的变化,筛选MI后脑部出现神经炎症反应的时间点;利用蛋白质组学技术探究MI后神经炎症反应相关的蛋白网络,并以脑心通方(胶囊)为探针,通过解析方剂作用的效应分子,揭示MI后神经炎症反应的关键蛋白,同时帮助阐释脑心通方(胶囊)“脑心同治”的药效作用机制。研究内容1.对MI后出现神经炎症反应的时间点进行研究。采用大鼠冠状动脉左前降支结扎模型,对MI后1、3、5、7d四个时间点的大鼠心脏组织进行病理染色,对脑组织进行小胶质细胞的免疫荧光标记,评价神经炎症反应,确认MI后脑部最早出现神经炎症反应的时间点。2.基于蛋白质组学技术的MI后心脏组织和大脑皮层组织的差异蛋白分析。根据前期结果,选择MI后1、3、7d三个时间点,利用DIA蛋白质组学技术分析MI后心脏组织和大脑皮层组织的蛋白表达量变化,通过生物信息学分析,寻找差异表达蛋白,初步筛选与MI后神经炎症反应发生相关的差异蛋白。3.通过脑心通方(胶囊)对MI后神经炎症反应的药效学评价和机制探究揭示MI后出现神经炎症反应的关键蛋白及脑心通方(胶囊)的关键作用分子。以人体等效剂量为脑心通方(胶囊)中剂量,以1/2和2倍的人体等效剂量为低剂量和高剂量,对SD大鼠预给药7 d后进行MI模型构建,分别于术后1d和7 d取材。通过心脏梗死面积、组织病理染色和IBA-1标记脑部小胶质细胞进行脑心通方(胶囊)的药效学评价;选择最佳给药剂量,并基于DIA蛋白质组学技术探究脑心通方(胶囊)的药效作用分子,结合第二章的蛋白网络结果进行核心蛋白的筛选和验证。研究结果1.MI后脑部出现神经炎症反应心脏组织HE染色和Masson染色结果表明,MI后1 d,左心室组织出现炎性细胞浸润,MI后3d心肌组织开始出现蓝染胶原纤维,且随着缺血时间延长,纤维化面积逐渐增大,心肌损伤加重,表明由心肌梗死逐渐发展为心肌纤维化。脑组织病理染色结果表明,大脑并未出现显著的细胞损伤;免疫荧光染色结果表明,MI后1d,IBA-1的表达在皮层出现显著性升高,MI后3d表现为增加的趋势,并在MI后5 d、7 d维持高表达状态,表明小胶质细胞激AZD9291作用活,脑部出现神经炎症反应。2.MI后出现神经炎症反应的差异蛋白网络构建MI后1、3、7d的心脏组织蛋白质组学结果表明,随着缺血时间改变,差异蛋白的表达量发生变化,其功能涉及炎症反应、氧化应激、心肌纤维化等多个病理过程;大脑皮层组织有少量蛋白表达量被上调,且在不同时间点发生动态变化,蛋白功能涉及补体凝血级联反应、线粒体转运、细胞粘附等生物学过程。心脑之间的差异蛋白存在互作关系,表明心脑之间存在潜在的关键蛋白。通过与脑部疾病进行关联,筛选与神经炎症相关的差异蛋白,得到17个差异蛋白:蛋白补体C3(C3-beta-c,C3)、补体成分 4-结合蛋白(C4b-binding protein alpha chain,C4BPA)、补体因子(Complement factor properdin,CFP)、线粒体核糖体蛋白S14(Mitochondrialribosomalprotein S14,MRPS14)、钙网蛋白(Calreticulin,CALR)、整合素 β(Integrin beta,ITGB3)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN1)、蛋白聚糖(Versican,VCAN)、巨噬细胞帽盖蛋白(Macrophage-cappingprotein,CAPG)、整合素α3 变体 A(Integrin alpha 3 variant A,ITGA3)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK11)、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)、39S 核糖体蛋白 L22(39S ribosomal protein L22,MRPL22)、Ras 相关蛋白 Rab-28(Ras-related protein Rab-28,RAB28)、酪氨酸蛋白激酶受体(Tyrosine-protein kinase receptor,RPTKs)、三磷酸腺苷结合盒转运体 G4(ATP binding cassette transporter G4,ABCG4)、超长链脂肪酸蛋白 5(Elongation Of Very Long Chain Fatty Acids Protein 5,ELOVL5)。3.脑心通方(胶囊)药效学评价及机制探讨(1)药效结果表明,脑心通方(胶囊)中剂量(220mg/kg)可以显著减轻心肌损伤:显著缩小MI后大鼠的心脏梗死面积、减轻心脏组织病理损伤、减小心肌纤维化面积、降低心脏组织炎性细胞浸润;同时可以显著改善脑部皮层组织的小胶质细胞激活。(2)蛋白质组学分析结果表明,脑心通方(胶囊)可显著降低大脑皮层中ABCG4、ELOVL5、DNA 连接酶 3(DNA ligase3,Lig3)、自噬相关蛋白 2(Autophagy-related 2A,ATG2A)、氯化物通道蛋白 7(H(+)/Cl(-)exchange transporter7,CLCN7)的蛋白表达量。分子对接结果表明,ABCG4与脑心通方(胶囊)关键成分芍药苷、丹参酮IIA、阿魏酸均具有自发结合能力;WB实验结果表明,脑心通方(胶囊)给药组的ABCG4蛋白表达量被显著回调;进一步的CETSA的实验结果表明,随着温度升高,脑心通方(胶囊)给药组的ABCG4蛋白降解被延迟。综上,表明脑心通方(胶囊)可改善MI后心肌损伤,减轻脑部小胶质细胞的激活,降低神经炎症反应;脑心通方(胶囊)可显著改善相关蛋白的表达量,其中ABCG4可能是MI后神经炎症反应发生的关键蛋白。结论1.通过研究MI后脑部神经炎症反应,结果表明MI后1d,脑部出现了小胶质细胞的活化,且在7d内持续存在。2.利用蛋白质组学探究MI后神经炎症反应的差异蛋白。LY294002采购结果表明,MI后脑部神经炎症反应的出现伴随心脏和大脑皮层组织的多个蛋白的表达量变化,且心脑之间的差异蛋白存在相互作用关系,其功能涉及多个病理环节,通过筛选得到了 17个可能的差异蛋白。3.药效学评价结果表明,脑心通方(胶囊)对MI后的心肌损伤以及脑部小胶质细胞的活化具有较好的干预作用;蛋白质组学结果表明,脑心通方(胶囊)可显著调控ABCG4的表达量变化,结合前期研究表明,ABCG4可能是心肌梗死后出现神经炎症反应的关键蛋白。