乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居我国女性恶性肿瘤之首,严重威胁着广大女性的身心健康。以阿霉素为代表的蒽环类药物是乳腺癌治疗的一线药物,虽然对于乳腺癌的治疗有一定的效果,但是因为其耐药性,仍会出现肿瘤的复发、转移,这也是导致化疗失败的重要原因。中期因子(Midkine,MK)是一种肝素结合生长因子,在妊娠中期高度表达。MK具有多种生物学功能,促进血管的生成、神经元的生长、炎症修复等。作为分泌型生长因子,在多种实体瘤的血清中高度表达,并参与肿瘤的发生与生长,与肿瘤的预后显著相关,这些表明MK可能是治疗癌症的候选分子靶标。此外研究发现,在肿瘤中高表达的MK能够增强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性,这提示MK与肿瘤耐药有关。因此,本研究探讨MK对人乳腺癌细胞阿霉素敏感性的影响,为乳腺癌阿霉素耐药患者的临床治疗提供新的思路。本实验通过合成MK基因并构建表达载体,筛选出阳性重组表达质粒。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导MK蛋白表达,并对表达条件进行优化,按照最佳条件进行培养,用镍柱对融合蛋白SUMO-MK进行纯化,经SUMO蛋白酶酶切后再次使用镍柱纯化获得无标签的MK蛋白并作用于细胞来确定其活性,通过外源性蛋白MK刺激阿霉素作用的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞以及沉默MK后对阿霉素作用的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的影响。具体的研究内容如下:(1)根据大肠杆菌密码子使用偏好性对MK基因序列优化,构建p ET30a-MK质粒,对p ET28a-SUMO和p ET30a-MK进行Nde I和Bam HI双酶切,通过T4连接酶连接,构建原核表达载体p ET28a-SUMO-MK,分别转化DH5α和BL21(DE3Belumosudil半抑制浓度)感受态细胞中,通过PCR,酶切和测序鉴定,大小和序列正确,诱导表达的融合蛋白在29KDa处存在条带与预期相符,且蛋白为可溶性表达。(2)利用Box-Behnken实验设计原理以温度、诱导剂浓度、诱导时间、溶氧量为考察因素,融合蛋白SUMO-MK的含量占总蛋白含量的百分比值为响应值,对诱导条件进行优化,根据实际操作融合蛋白SUMO-MK在装液量为30%,OD_(600)值为0.6-0.8时,终浓度为0.4m M的IPTG在36℃的条件下诱导5h。(3)用镍柱在不同浓度的咪唑对融合蛋白SUMO-MK进行洗脱,在250m M浓度的咪唑条件下可将融合蛋白洗脱下来。经SUMO蛋白酶酶切后,再次经镍柱纯化,收集流穿,经Western blot验证,所得到的流穿即为MK蛋白溶液。通过细胞增殖和划痕实验验证了MK蛋白的生物学活性。(4)梯度浓度的阿霉素作用的MCF-7、MDA-MB-231细胞中加入自制纯化的MK蛋白,MTT实验结果显示,MK刺激的给药组较单给药组存活率提高(P<0.05,P<0.05),且IC_(50)值也增加;在阿霉素作用MCF-7、MDA-MB-231细胞的同时加入梯度浓度MK,流Farmed sea bass式结果表明,不同浓度的MK刺激后,凋亡率随MK浓度升高而降低(P<0.001,P<0.001),MK蛋白抑制细胞凋亡具有浓度依赖性。(5)利用MK干扰质粒,将sh-NC、sh-MK-1、sh-MK-2转染MCF-7、MDA-MB-231细胞,在转染24h后,通过q RT-PCR法和Western blot法结果表明sh-MK-2的干扰效率最好。MTT结果表明获悉更多,沉默MK的表达后,MCF-7、MDA-MB-231细胞的存活率明显比单给药组降低(P<0.05,P<0.05),IC_(50)值降低;流式结果表明,沉默MK的表达后,在阿霉素的作用后MCF-7、MDA-MB-231细胞的凋亡率增加(P<0.001,P<0.001);Western blot法检测凋亡蛋白Cleaved PARP的表达,结果表明,在沉默MK表达的MCF-7、MDA-MB-231细胞,加入阿霉素作用后Cleaved PARP的表达量明显增加(P<0.01,P<0.01)。综上所述,本研究成功构建重组表达质粒p ET28a-SUMO-MK,通过对其表达条件的优化,提高了融合蛋白的表达量,经纯化后获得成熟的MK蛋白。通过探讨MK对乳腺癌阿霉素敏感性的相关实验表明,MK能够提高乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的存活率,在细胞内沉默MK的表达促进阿霉素作用乳腺癌细胞的凋亡,增加乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性,为后续研究乳腺癌耐药机制及乳腺癌的临床治疗奠定基础。