随着人口老龄化的加速到来,衰老相关的表型和疾病机理成为生命医学领域的研究热点和难点。衰老是一个极其复杂且多维的过程,由细胞衰老(cellular senescence)的不断累积造成多个组织和器官功能的衰退导致机体衰老。不同器官发生衰老的年龄不同,脑、皮肤等器官衰老时间较早,肝脏、膀胱等衰老较晚。在多种损伤性刺激下,细胞发生衰老时进入永久性细胞周期停滞,同时伴随着大分子改变及炎症相关因子的分泌,且与再生障碍密切相关。因此探究衰老早期表型和发生机制对老龄化过程中重大疾病发生发展的影响,对衰老与疾病预防和干预具有重要意义。肝脏作为哺乳动物体内最大且最关键的器官之一,主要行使代谢、解毒、合成和分泌等重要功能,并通过内分泌信号、脂质代谢等与其他器官相互作用。肝脏具有强大再生能力。与其他器官相比,在鼠龄22-24个月(约等于人65-70岁)以后肝脏才会出现包括体积减少、再生能力下降在内的明显的衰老表型。衰老的肝脏出现肝细胞多倍体增加、DNA损伤、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增加,同时衰老相关分泌表型(Senescence associated secretory phenotype,SASP)积累诱发Mercury bioaccumulation炎症。非酒精性脂肪肝等疾病发生进程中也伴随着病理性衰老。机体衰老早期肝脏发生的表型变化仍不明确,肝脏是否通过脂质代谢、蛋白合成和分泌在衰老早期加速其他器官衰老?这些因素引起肝脏早期衰老表型的机制又是什么?本课题在前期发现肝脏可通过代谢、分泌功能影响衰老早期表型的基础上,旨在通过原创探索性实验明确肝脏衰老早期的具体表型,并初步探究这些表型产生的具体分子机制。本研究首先通过评估衰老早期供体肝脏移植后受体再生能力和对其他器官的影响,其次通过脂质、蛋白组学明确衰老早期肝脏在脂质代谢、蛋白分泌中发生的变化,最后在细胞系中初步验证了神经酰胺代谢调控肝脏衰老的作用,得到的结果包括:一、肝脏早期衰老对损伤再生能力无显著影响,但导致大脑神经元数目减少和功能基因表达异常。为明确衰老早期肝脏的功能变化,本研究首先分离18个月的C57BL/6小鼠(约等于人56岁左右,定义为肝脏衰老早期组)和2-3个月的C57BL/6小鼠(约等于人18岁左右,成年对照组)肝脏消化成单细胞,将获得的相同数目的对照及衰老组小鼠原代肝细胞移植到URG~(?)背景的肝损伤免疫缺陷小鼠中(基因型为NOD.Cg-Tg(tetO-Alb-uPA)1Deng Rag2~(tm1Vst)I12~(rgtm1Vst)/Vst),受体小鼠持续喂食DOX(doxycycline,强力霉素)饮水诱发肝损伤。本研究对损伤肝脏重建进行评估,发现肝细胞移植后60天的肝功ALT、AST分泌水平、肝脏组织形态和增殖细胞的数目在衰老和对照组间没有差异,表明肝脏早期衰老对再生能力没有显著影响。随后,对移植后90天的容易发生衰老的小鼠的脑组织进行染色,发现神经元标志物NeuN阳性细胞数目显著下降,表明移植衰老早期肝细胞的小鼠神经元细胞数目减少。通过对大脑皮层海马组织进行转录组测序,移植衰老早期肝细胞的小鼠在离子转运、突触等通路下调,ECM相关成分发生改变,以上结果表明肝脏衰老早期肝脏再生能力没有显著变化,但通过代谢或分泌功能诱导易早衰器官如大脑的神经元数目和基因表达改变。二、肝脏衰老早期CerS2及其催化产物C24神经酰胺显著下调。为进一步明确肝脏衰老早期代谢、蛋白合成或分泌的表型变化,本研究收取衰老早期和对照C57/B6小鼠的肝脏分别进行非靶CH-223191向脂质代谢组学(n=10)和蛋白组学(n=6)质谱分析,从而明确肝脏早期衰老的脂质代谢和蛋白变化。结果显示样本聚类良好,在鉴定到的变化的33种脂质亚类中,衰老小鼠肝脏甘油三酯(Triglyceride,TG)显著升高,50种鞘脂类的中间代谢产物神经酰胺(Ceramide,Cer)分子在肝脏衰老早期显著降低。随后,本研究通过高效液相色谱法(HPLC)验证了不同酰基链长的神经酰胺的变化水平,发现早期衰老小鼠肝脏较短酰基链的C16、C22神经酰胺没有显著变化,较长酰基链的C24神经酰胺明显降低。神经酰胺是细胞膜的重要成分和第二信使,与疾病发生密切相关,此结果提示C24神经酰胺相关代谢通路可能在肝脏衰老早期发挥作用。神经酰胺是由神经酰胺合成酶(Ceramide synthase,CerS)代谢合成的。本研究共检测到308种上调和228种下调的差异表达蛋白,其中神经酰胺合成酶2(CerS2)和神经酰胺合成酶6(CerS6)显著变化,CerS2优先催化合成具有较长酰基链的C24的神经酰胺。运用Western Blot验证了衰老组肝脏中CerS2蛋白水平降低,CerS6蛋白水平升高,与C24神经酰胺水平的降低一致。在细胞病理衰老密切相关的非酒精性脂肪肝模型中,运用RT-PCR和Western Blot检测发现CerS2蛋白表达也减少,p53表达增加。三、CerS2调控肝脏早期衰老机制的初步探究。为进一步明确CerS2影响肝脏早期衰老的初步机制,本课题设计特异干扰Cers2表达的siRNA、构建CerS2慢病毒过表达载体,在小鼠肝细胞系AML12中干扰或过表达CerS2,并通过RT-PCR和Western Blot验证CerS2的敲低及过表达效率。在未处理细胞、H2O2和阿霉素诱导AML12的不同细胞衰老模型中,发现敲低Cers2后p16蛋白水平降低,过表达CerS2后p16蛋白水平升高。因此,CerS2通过调控p16途径参与肝脏细胞衰老调控。综上,本研究作为探索性研究,首先通过评估衰老早期供体肝脏移植后受体再生能力和对其他器AY-22989体外官的影响,发现肝脏细胞衰老对重建损伤肝脏能力无显著影响,通过代谢、蛋白合成或分泌等对易衰器官大脑神经元和细胞外基质产生影响。通过脂质组学、蛋白组学明确了衰老早期肝脏CerS2表达下降导致C24神经酰胺降低,在细胞系中初步发现了 CerS2通过p16调控肝脏衰老。本研究为肝脏衰老研究提供了新思路,为自然和病理性肝脏早期衰老的机制和治疗提供了新线索。