目的:探究在高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)病理状态下,尝试运用网络药理学方法,基于“六味痛风饮”这一降尿酸中药复方,构建“降尿酸化合物-高尿酸血症”结合的调控网络,对六味痛风饮复方中降尿酸功效成分/群进行组合预测;对网络药理学预测降尿酸功效的化合物进行初步筛选,通过体外黄嘌呤氧化酶抑制活性筛选平台进行单个化合物的黄嘌呤氧化酶的抑制活性筛选,并对筛选的化合物进行组合验证是否具有协同功效的作用;根据前期构建的六味痛风饮治疗高尿酸血症的成分-靶点-疾病网络,发现PI3K-Akt信号通路为降尿酸关联性最高的通路,该通路在细胞的各种生理活动中都起着一定调节作用,如可调控细胞增殖、凋亡等,和很多疾病的发生发展密切相关,因此基于HK-2细胞模型对PI3K-Akt信号通路进行实验验证;以期预测中药复方中具有降尿酸功效成分/群,为高尿酸血症的防治提供新的思路和策略。方法:1.利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)和genetics servicesWeb of Science数据库进行研究,收集六味痛风饮中可能具有降尿酸活性的化合物,得到化合物库。基于TCMSP和Swiss Target Prediction数据库收集预测化合物的靶点数据。对Gene Cards数据库及OMIM数据库进行检索,筛选疾病(高尿酸血症)相关靶点,与化合物靶点取交集,构建蛋白互作网络图。通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,预测出六味痛风饮降尿酸作用的潜在通路,并分析通路来找到可能存在的协同作用组合。2.对网络药理学预测出的可能具有降尿酸活性的54种化合物进行黄嘌呤氧化酶抑制活性筛选,经收集共得到31种化合物。以别嘌呤醇作为阳性对照,根据各化合物的浓度及平均抑制率计算得出IC50值,以抑制活性较好的几个化合物的IC50对应的浓度比进行组合实验。对抑制活性较好的组合进行进一步优化,按照化合物A:化合物B=1:2,2:1的比例重新进行组合,测定新组合的黄嘌呤氧化酶抑制活性。3.对HK-2细胞进行培养:复苏、传代、冻存后进行Western Blot实验;并对PI3K-Akt通路预测的化合物组合进行实验验证。将HK-2细胞接种在六孔板上,长至80%后给予不同的化合物组合,通过Western Blot技术检测URAT1和GLUT9的蛋白表达。结果:1.通过TCMSP和Web of Science数据库收集可能具有降尿酸活性的化合物54个,相关靶点1247个。在Gene Cards和OMIM数据库中获得2007个疾病靶点。将化合物靶点和疾病靶点进行合并,得到172个交集基因,导入STRING数据库中,获得的蛋白互作网络共有172个节点。GO功能和KEGG通路富集分析结果表明,通过抑制PI3K-Akt信号通路的表达,可以抑制肾脏中尿酸转运蛋白URAT1和GLUT9的表达来抑制尿酸的重吸收,促进了体内尿酸的排泄。2.单一作用发挥嘌呤氧化酶抑制活性的组分研究结果,芹菜素的抑制活性最好,各化合物的抑制活性大小为芹菜素>木犀草素>山奈酚>槲皮素>秦皮乙素>橙皮素。将化合物进行两两组合,以IC50值所对应的浓度进行1:1组合进行下一步研究。协同作用发挥嘌呤氧化酶抑制活性的组分群研究结果,芹菜素与槲皮素、秦皮乙素显示出叠加效应;木犀草素和秦皮乙素的组合为叠加效应;山柰酚-槲皮素、秦皮乙素和橙皮素的体系,均显示叠加效应。这些结果表明,单个化合物活性较强的情况下与其他活性较强的化合物组合给药可能是简单的叠加效应。协同作用组分群的研究,对化合物组合中存在的比例进行调整,分别考察1:2,2:1比例对组合,其中6个组合显示叠加效应,分别为芹菜素:山奈酚(1:2)、芹菜素:槲皮素(1:2)、芹菜素:槲皮素(2:1)、芹菜素:橙皮素(2:1)、木犀草素素:山奈酚(2:1)、秦皮乙素:橙皮素(2:1)。随着木犀草素的比例升高,组合由拮抗作用变为叠加效应。综上所述,化合物组合比例不同,呈现的效应也会不同。3.PI3K-Akt通路的实验验证中,白藜芦醇+柚皮素对HK-2细胞URAT1和GLUT9蛋白表达水平的研究结果表明,与空白组相比,白藜芦醇/柚皮素在浓度小于2μg/m L时无法下调URAT1和GLUT9的蛋白表达量,且无明显差异(p>0.05),当浓度为4μg/m L时,白藜芦醇/柚皮素能显著抑制UA上调URAT1的水平(p<0.0MC3生产商1)。表明预测的药物组合能影响UA介导URAT1蛋白表达,可能达到降尿酸的目的。白藜芦醇+芹菜素对HK-2细胞URAT1和GLUT9蛋白表达水平的研究表明,与空白组相比,白藜芦醇/芹菜素在不同浓度时均无法下调URAT1和GLUT9的蛋白表达量,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:1.网络药理学研究结果表明,通过抑制PI3K-Akt信号通路的表达,可以抑制肾脏中尿酸转运蛋白URAT1和GLUT9的表达来抑制尿酸的重吸收,促进体内尿酸的排泄,达到治疗高尿酸血症的目的。2.单一作用发挥嘌呤氧化酶抑制活性的组分研究结果,芹菜素的抑制活性最好,各化合物的抑制活性大小为芹菜素>木犀草素>山奈酚>槲皮素>秦皮乙素>橙皮素。将化合物按照1:1进行两两组合,结果表明,单个化合物活性较强的情况下与其他活性较强的化合物组合可能是简单的叠加效应。协同作用组分群的研究,对化合物组合中的比例上调至1:2或2:1,结果表明,有6个组合显示叠加效应,有些化合物随着比例升高,组合由拮抗作用变为叠加效应。3.基于Western Blot实验结果,PI3K-Akt通路的实验验证中,当浓度为4μg/m L时,白藜芦醇/柚皮素能显著抑制UA上调URAT1的水平(p<0.01)。与空白组相比,白藜芦醇/芹菜素在不同浓度时均无法下调URAT1和GGefitinib溶解度LUT9的蛋白表达量,差异无统计学意义(p>0.05)。