研究背景:随着体外诊断技术的快速multiple antibiotic resistance index发展,免疫层析技术(ICA)已经成为应用于床旁快速检测(POCT)的重要手段之一。目前免疫层析技术最具代表性的应用是胶体金免疫层析试纸,应用该试纸可以对特定抗原进行快速定性检测。但受到示踪物的影响,胶体金免疫层析技术等无法实现定量检测。时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是将稀土元素离子作为抗体示踪物,通过延时检测,就可以将特异性荧光与非特异性荧光区别开来的一种定量检测分析方法,在该技术的基础上建立的时间分辨荧光免疫层析技术(TRFICA)是将时间分辨荧光免疫原理与免疫层析技术相结合,用镧系元素制备的标记物代替胶体金等物质对抗体等生物大分子进行标记,在以固相层析材料构建体系中发生特异性反应后,用时间分辨仪器对检测区进行扫描,检测线(T线)和质控线(C线)的镧系元素受激发后发出荧光,测定其荧光强度并转换成为数字信号,从而可以实现快速定量分析的目的。标记物是时间分辨荧光免疫层析技术的重要组成部分,通过标记物可以将Eu~(3+)和生物大分子连接到一起,形成“生物大分子-CA-Eu~(3+)”的螯合物,进而可用于时间分辨荧光免疫分析中目标物的标记。标记物种类较多,其理化性质存在较大差异,选择合适的标记物对于时间分辨荧光免疫层析技术的建议尤为重要。研究方法:本研究主要包含两部分内容。第一部分是对实验室前期制备的五种标记物进行筛选,主要考察每种标记物的溶解性、荧光强度、蛋白标记能力、最佳孵育时间和温度、交联摩尔比等,从中筛选出一种荧光强度高、标记效率高的标记物。第二部分是利用筛选得到的标记物,以乙肝单克隆抗体为标记目标物,根据时间分辨荧光免疫分析技术的原理,通过对试纸条NC膜、质控线、检测线包被浓度的选择、样品垫以及结合垫的处理条件进行优化,建立了一种可用于乙肝检测的建立乙肝时间分辨免疫层析法方法(时间分辨荧光免疫层析试纸),在此基础上对其性能进行了分析测定。研究结果:标记物筛选实验结果表明,五种标记物中,标记物A的最佳反应溶液为PBS(0.01 M p H 7.5),标记物B的最佳反应溶液为PBS(0.01 M p H 8.5),标记物C的最佳反应溶液是PBS(0.01 M p H 8.5),BHHCT的最佳反应溶液是CBS(0.05 M p H 8.9),BHHST的最佳反应溶液是CBS(0.1 M pH 8.9),在最佳反应溶液中标记物BHHCT的标记和发光效率最高,标记物A、标记物B、标记物C、BHHST的最佳交联摩尔比为1:30,BHHCT的最佳交联摩尔比为1:60,蛋白最佳的孵育时间和温度是2 h和37℃,层析凝胶选择Sephadex G-25,洗脱液选择Tris-HCl(0.05 M p H 8.0)。综合以上结果,选择BHHCT作为最佳标记物。以B获悉更多HHCT为标记物建立乙肝时间分辨荧光免疫层析方法,样品垫用0.01M PBS(内含1%BSA,5%Tween20)浸泡,结合垫选择用层析后收集液原液浸泡,NC膜选择CN140,检测线采用1.5 mg/m L包被浓度的乙肝多抗进行包被,质控线采用1 mg/m L包被浓度的羊抗鼠抗体进行包被,最佳检测时间是25 min。试纸条性能分析测定结果表明其抗原浓度T/C比值与T线荧光强度拟合曲线y=2687.8x-10818,R~2=0.9941,呈良好的线性,灵敏度较低,特异性较优且无交叉反应,重复性良好,经高温破坏实验证明,该试纸条具有良好的稳定性。研究结论:本点击此处研究从五种标记物中筛选出一种发光能力最佳的稀土标记物BHHCT,应用该标记物建立了一种用于乙肝检测的乙肝时间分辨荧光免疫层析方法(抗原检测试纸),该试纸条具有一定的特异性和稳定性,可有效的对乙肝抗原进行定量分析。本研究将对时间分辨荧光免疫层析技术研究和产品开发提供新的思路。