胞苷作为一种嘧啶核苷,是生物体内RNA的结构成分,参与多种细胞代谢过程,可用作某些抗肿瘤和抗病毒药物的前体。本研究主要从全局角度着重解决胞苷生物合成中心碳代谢不平衡问题,基于发酵特性、基因表达以及细胞内代谢通量分布,研究了pgi和edd基因敲除对好氧条件下大肠杆菌胞苷合成的影响。主要研究内容和结果如下:(1)大肠杆菌pgi和edd基因缺失对胞苷发酵的影响。为增强磷酸戊糖(PP)途径的代谢通量,以大肠杆菌K12为出发菌株,应用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)基因编辑技术对大肠杆菌染色体上的磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi与6-磷酸葡萄糖酸脱水酶编码基因edd进行敲除,分别获得pgi缺失菌株E.coli NXBG-14和edd缺失菌株E.coli NXBG-15。对重组菌株胞苷生物合成途径关键酶基因和发酵产胞苷进行研究,结果表明,pgi基因敲除后PP途径deoC和deoB基因的表达量上调,有利于胞苷的合成。edd基因敲除后,ED途径的关键酶基因eda表达量下降,减少了PP途径的碳流分支。对重组菌株摇瓶发酵40 h后,E.coli NXBG-14耗糖量较出发菌提高了1.04倍,胞苷含量较出发菌提高了1.62倍(产胞苷2.82 g/L),E.coli NXBG-15耗糖量提高了1.09倍,胞苷含量提高了1.64倍(PD0325901抑制剂产胞苷2.85 g/L),说明pgi和edd基因敲除均能够将碳流引向有利于胞苷合成的途径。(2)重组菌株的转录组学分析。通过转录组分析出发菌株E.coli K12以及重组菌E.coli NXBG-14和E.coli NXBG-15的基因表达水平,并解析基因改造影响胞苷合成过程的机制。结果表明,对照组E.coli K12和重组菌E.coli NXBG-14共有1363个差异表达基因(DEGs),有697个基因上调,666个基因下调,重组菌E.coli NXBG-14和E.coli NXBG-15共有630个差异表达基因,有403个基因上调VX-445 NMR,227个基因下调。对这些差异表达基因进行GO/KEGG注释和富集分析我们发现pgi和edd基因缺失不仅可以提高细胞对葡萄糖的吸收还能够还有助于解除磷酸转移酶系统(PTS)中分解代谢阻遏,使葡萄糖代谢进入PP途径,促进胞苷前体物的合成。另外,相比于出发菌株E.coli K12,重组菌E.coli NXBG-14中糖酵解途径(EMP)中转录水平变化显著,大部分基因表达量均呈上调趋势,促进了能量物质的合成。(3)重组菌株的代谢流组学分析。利用~(13)C代谢流量分析(~(13)C-metabolic flux analysis,~(13)C-MFA)技术,通过标记葡萄糖同位素准确定量重组菌株胞内的碳代谢通量分布。本研究以出发菌株E.coli K12以及重组菌E.coli NXBG-14和E.coli NXBG-15为研究对象,采用~(13)C-MFA平台进行分析。结果表明,pgi和edd基因敲除会提高菌体的糖代谢能力。另外,通过分析代谢途径中关键代谢物的含量变化发现,重组菌和出发菌代谢差异较大,中心碳代谢产物变化明显。重组菌PP途径的6-磷酸葡萄糖酸浓度较高,EMP中果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸浓度明显提升,三羧酸循环(TCA)中相关物质浓度相对较低,其它副产物浓度也较低。最后经转录组学与代谢流组学的联合分析发现,大多数中心碳代谢途径(CCM)代谢物与DEGs在对胞苷生物合成的能量代谢中可能发挥正向调节作用。综上,本研究采用转录组、~(13)C代谢流和定量代谢物组学技术,解析了大肠杆菌pgi和edd基因敲除前后细胞内基因表达及胞苷代谢通量的变化,证biologic agent明pgi和edd基因敲除有利于胞苷前体物合成途径中关键基因的表达,改变了碳流方向和减少碳流分支,增强了胞苷的合成。