系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以多脏器受累为主要特征的慢性自身免疫性疾病,糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)一直是控制狼疮活动的基础用药。近年来越来越多natural bioactive compound证据显示GC副作用可以引起SLE患者器官损害,已成为SLE的主要损害因素之一,是当前SLE领域的热点和难点。研究表明,糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptors,GR)是介导GC作用的最重要分子,属核受体,也可易位至线粒体,目前GC线粒体调控作用不明确。国医大师禤国维教授拟滋阴清热复方治疗SLEMLN8237供应商,更多临床研究发现可以协助撤减GC,疗效确切,但机制不明。因此滋阴清热复方减毒糖皮质激素副作用的机理值得探索。目的体外实验:在GC线粒体调控起始环节GR线粒体易位,采用GR线粒体易位拮抗剂干预,观察RAW264.7线粒体、细胞质、细胞核GR含量;线粒体呼吸链基因MTCO1、线粒体呼吸链复合物Ⅳ的活性;线粒体功能与氧化应激,探讨GC线粒体途径调控,通过GR线粒体易位,对线粒体功能的影响。体内实验:探讨滋阴清热复方、NAC与mito Q对地塞米松所致MRL/lpr小鼠线粒体功能异常影响。方法体外实验:选用目前自身免疫性疾病体外机制研究中常用的细胞系:小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),通过预实验,将细胞分为4组:(1)control组:无任何干预,加入DMEM培养基;(2)地塞米松组:应用250nm的地塞米松处理RAW264.7;(3)Tubastatin-A组:应用最佳浓度(10um)的Tubastatin-A处理RAW264.7;(4)地塞米松+Tubastatin-A组:250nm地塞米松+10um Tubastatin-A干预RAW264.7。干预24小时后,使用线粒体分离试剂盒分离亚细胞,使用组蛋白H2B、α-微管蛋白和VDAC6的抗体,排除了核、胞质和线粒体组分之间的交叉污染。Western Blot检测线粒体、细胞质、细胞核GR蛋白含量的变化,荧光定量PCR和Western Blot检测MTCO-1m RNA与蛋白的表达情况,ELISA方法检测线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性,荧光观察线粒体活性氧(mt ROS)、线粒体膜电位(MMP)及线粒体通透性转换孔(m PTP)的变化,比色法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表达差异。体内实验:50只8周龄的MRL/lpr小鼠随机分为狼疮鼠组、地塞米松组、滋阴清热复方+地塞米松组、NAC+地塞米松组、mito Q+地塞米松组,每组10只;另选Balc/b小鼠为空白对照组,共10只;分别于干预12周后,取肾脏组织,通过荧光定量PCR与蛋白质印迹(Western-blot,WB)检测线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基1(MT-CO1)和白细胞介素(interleukin,IL)-1β的m RNA及蛋白表达水平;ELASA法检测线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性;比色法检测丙二醛、超氧歧化酶表达差异。结果体外实验结果:1、GR含量变化:与正常组相比,地塞米松干预增加了RAW264.7细胞中的线粒体和核GR含量,Tubastatin-A抑制了线粒体的这种作用,但核GR没有显著减少。与DEX组相比,地塞米松+Tubastatin-A处理增强了GR的胞质保留,而单独使用Tubastatin-A治疗与对照组相比,没有改变不同亚细胞级的GR水平。2、线粒体基因MT-CO1与线粒体呼吸链复合物Ⅳ的变化:与正常组相比,地塞米松组MTCO1表达减少,线粒体复合物Ⅳ活性降低;而Tubastatin-A干预后,可以逆转地塞米松引起的MTCO1和线粒体复合物Ⅳ的表达异常。3、线粒体功能与氧化应激:与正常组相比,地塞米松组增加了mt ROS表达和m PTP的开放,降低了线粒体膜电位;而Tubastatin-A+地塞米松组mt ROS表达和m PTP开放降低,膜电位升高。与正常组相比,地塞米松组MDA含量增加,SOD活性降低;而Tubastatin-A+地塞米松组改变了MDA与SOD的异常。体内实验结果:1、与正常鼠组相比,狼疮鼠组肾脏线粒体呼吸链基因表达MT-CO1、线粒体复合物Ⅳ活性、SOD活性降低;MDA含量升高;炎症因子IL-1β表达升高。2、与狼疮鼠组相比,地塞米松组肾脏线粒体呼吸链基因表达、线粒体复合物Ⅳ活性降低、MDA含量升高;炎症因子IL-1β表达降低。3、与地塞米松组比,滋阴清热复方+地塞米松组、NAC+地塞米松组与mito Q+地塞米松组表达肾脏线粒体呼吸链基因表达MT-CO1、线粒体复合物Ⅳ活性及SOD活性升高、MDA含量降低,炎症因子IL-1β表达无明显变化。4、与NAC+地塞米松组相比,滋阴清热复方+地塞米松组肾脏线粒体呼吸链基因表达MT-CO1表达升高;5、与mito Q+地塞米松组相比,滋阴清热复方+地塞米松组线粒体基因MTCO1表达下降,SOD活性下降。结论GC对线粒体呼吸链功能的损害,可能是GC副作用所致狼疮鼠肾脏损害的新机理,滋阴清热复方在发挥协同GC抗炎同时,可以有效改善GC副作用所致肾脏线粒体功能损害,具有类似线粒体内抗氧化的作用。