背景和目的:糖尿病心血管相关疾病是糖尿病常见并发症之一。糖尿病心肌损伤(Diabetic myocardium injury,DMI)是指由糖尿病引起的、心脏结构和功能异常的一种病理状态。DMI是糖尿病心肌病的临床早期阶段,其出现显著增加了糖尿病患者心力衰竭和死亡风险。目前,尚无DMI的特效治疗药物,在防治DMI过程中仍以预防为主。因此,在了解DMI发病机制的基础上,将防治关口前移,积极寻找能够预防DMI的天然产物,已成为当前研究热点之一。DNA表观遗传失调是导致DMI发生发展的重要原因之一。当DNA去甲tropical medicine基化过程受到抑制时,心脏关键结构和功能相关基因启动子区域的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)水平显著降低,进而导致心肌损伤。DNA去甲基化过程主要受α-酮戊二酸依赖的双加氧酶10-11易位蛋白(Ten-eleven translocation protein 1/2/3,TET1/2/3)家族调节,三羧酸循环的中间产物延胡索酸和琥珀酸可通过竞争α-酮戊二酸抑制TET酶活性;此外,腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通过磷酸化丝氨酸97和99位点来维持TET2的蛋白稳定性。前期研究发现,安石榴苷(Punicalagin,PU)和鞣花酸(Ellagic acid,EA)对心脏具有一定的保护作用,且分子机制与激活AMPK和改善线粒体功能密切相关。但尚未有研究报道PU和EA能否通过促进DNA去甲基化预防DMI的发生。本论文包括两部分,第一部分通过病例对照研究探讨外周血DNA中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)和5hm C水平与心脏功能的关系;第二部分通过动物实验探究PU和EA能否通过促进DNA去甲基化预防DMI的发生及其分子机制。方法:1.人群研究:(1)本研Q-VD-Oph究采用病例对照研究,在胶州市里岔镇招募153名志愿者,其中健康(Healthy,HL)志愿者50名、糖代谢异常(Abnormal glucose metabolism,AGM)志愿者49名和糖代谢异常心肌损伤(Abnormal glucose metabolism with myocardial injury,AGM+MI)志愿者54名。(2)通过问卷调查和体格检查收集志愿者的基本信息。采集志愿者空腹静脉血,并分离血清;采用全自动生化分析仪检测空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、甘油三酯(Triacylglycerol,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的浓度,以及血清心肌酶谱的活性,包括天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(Creatine kinase,CK)。利用斑点杂交实验检测志愿者外周血DNA中5m C和5hm C的水平。2.动物研究:(1)8周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周,随机分为以下6组(n=10):健康对照组(NC)、糖尿病模型组(DM)、白藜芦醇组(RS,100 mg/kg/day)、低剂量安石榴苷组(LP,50 mg/kg/day)、高剂量安石榴苷组(HP,100 mg/kg/day)和鞣花酸组(EA,100 mg/kg/day)。NC组饲喂脂肪供能比为10%的普通饲料,其余各组饲喂脂肪供能比为60%的高脂饲料。干预8周后,对小鼠进行腹腔糖耐量试验。小鼠休养5天,禁食过夜后处死,留取血液及心脏组织用于后续指标检测。(2)利用全自动生化分析仪检测血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的浓度,以及AST和CK的活性;利用酶联免疫吸附实验检测小鼠血清空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)的浓度;利用生化试剂盒检测小鼠心脏组织中总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽酶(Glutathione,GSH)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的水平;利用斑点杂交实验检测小鼠心脏DNA中5m C、5hm C和5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine,5f C)www.selleck.cn/products/BIBW2992的水平;利用免疫印迹实验检测小鼠心脏中肌球蛋白重链7B(Myosin heavy chain 7B,Myh7B)、含xin-肌动蛋白结合重复序列蛋白2(Xin actin-binding repeat-containing protein 2,Xirp2)、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)、TET、AMPK-乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl Co A carboxylase,ACC)、线粒体呼吸链复合酶以及三羧酸循环相关酶的蛋白表达水平;利用反转录聚合酶链反应检测小鼠心脏中TET的m RNA水平、线粒体DNA拷贝数;利用气相色谱-质谱联用仪检测小鼠心脏中三羧酸循环中间代谢产物水平。结果:1.人群研究:(1)志愿者的基本特征分析发现,在HL、AGM和AGM+MI组之间,年龄、性别、文化程度、舒张压水平、臀围、腰围、腰臀比、身高、体重、身体质量指数之间的差异均无统计学意义,但AGM+MI组的收缩压显著高于HL组。(2)志愿者的血清生化指标分析发现,在HL、AGM和AGM+MI组之间,血清中TC、HDL-C、LDL-C浓度及AST和LDH活性的差异均没有统计学意义。AGM和AGM+MI组的FBG浓度显著高于HL组,AGM组的血清TG浓度显著高于HL组。此外,AGM+MI组的血清CK活性显著高于HL和AGM组。(3)斑点杂交实验结果显示,DNA中5m C水平在AGM+MI、AGM和HL组之间的差异没有统计学意义。AGM+MI组DNA中5hm C水平显著低于HL和AGM组,5m C/5hm C比值显著高于HL和AGM组。(4)关联性分析发现,DNA中5m C水平与血清心肌酶谱AST、CK、LDH活性均无显著相关性,5hm C水平与血清AST(r=-0.4357,P<0.001)、CK(r=-0.5325,P<0.001)、LDH(r=-0.6291,P<0.001)活性均呈显著负相关。2.动物研究:(1)干预2周后,DM组小鼠体重显著高于其余各组。与DM组相比,补充PU和EA可以显著降低小鼠的心脏重量、心脏脏器系数、血糖水平、血糖曲线下面积、FINS浓度、血清AST和CK活性,并能够改善小鼠心脏和心肌细胞形态。PU和EA干预组中Myh7B的蛋白表达水平显著高于DM组,EA组Xirp2的蛋白表达水平显著高于DM组。(2)DNA中5m C水平在各组之间的差异无统计学意义,PU和EA组5hm C和5f C水平显著高于DM组。与DM组相比,PU和EA组DNMTs和TET1的蛋白表达水平、TET的m RNA水平的差异均无统计学意义;PU和EA组TET2的蛋白表达水平显著高于DM组,HP和EA组TET3的蛋白表达水平显著高于DM组。(3)LP组p-AMPK/AMPK的蛋白表达水平显著高于DM组。与DM组相比,补充PU和EA不仅可以提高心脏组织中T-AOC、SOD、GSH、CAT的水平、线粒体DNA拷贝数以及complexes II/III/V的蛋白表达水平,还可以提高顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶2、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶B和延胡索酸脱氢酶的蛋白表达水平。PU和EA干预小鼠心脏组织中延胡索酸和琥珀酸的含量均显著低于DM组小鼠,DM组(延胡索酸+琥珀酸)/α-酮戊二酸的比值显著高于其余各组。结论:病例对照研究发现,DMI的发生发展与DNA去甲基化过程被抑制密切相关,提示促进DNA去甲基化有望成为预防糖尿病心肌损伤的有效策略。动物实验发现,PU和EA通过改善线粒体功能,上调TET酶活性;PU通过激活AMPK上调TET2的蛋白稳定性,进而促进DNA去甲基化,预防糖尿病小鼠发生心肌损伤。