目的:糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是常见的糖尿病终末期并发症之一,具有较高的死亡率,严重影响糖尿病患者的生存质量。小细胞外囊泡(Small extracellular vesicles,sEVs)是由细胞分泌的具有多种生物学活性的双层膜结构的小囊泡,间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)来源的sEVs(MSC-sEVs)被证明在多种组织损伤修复过程中发挥了重要的作用,是新兴的“无细胞”疗法的新材料。本研究旨在探讨脐带MSC-sEVs对DCM的保护作用及潜在的作用机制。方法:组织贴壁法分离脐带MSC并进行培养Anti-periodontopathic immunoglobulin G扩增,流式细胞术检测MSC表面标志蛋白,MS-275半抑制浓度成骨和成脂诱导培养检测MSC多向分化潜能。收集MSC培养上清,采用超速离心法提取sEVs,透射电镜、纳米颗粒跟踪分析仪和Western blot对脐带MSC-sEVs进行鉴定和表征。体内实验采用db/db小鼠和STZ诱导的SD大鼠构建DCM模型,尾静脉注射脐带MSC-sEVs干预。超声心动图检测心脏功能,生化分析检测血清c Tn I心肌酶水平,HE染色检测心肌组织损伤程度,Masson染色和天狼星红染色检测心肌纤维化水平,TUNEL染色检测细胞凋亡情况。体外实验采用33m M高糖培养基加入300μM棕榈酸(HG/HF)刺激H9c2大鼠心肌细胞构建细胞模型,脐带MSC-sEVs及PBS进行干预处理,采用CCK8、Western blot、流式细胞术和DCFH-DA探针检测细胞增殖、凋亡和ROS水平。超高分辨电镜检测db/db小鼠心肌组织线粒体形态,Mito Tracker染色检测H9c2细胞线粒体形态,JC-1染色检测线粒体膜电位。Western blot检测细胞和组织中介导线粒体分裂和融合的关键蛋白表达水平,并通过免疫荧光进行验证。采用si RNA敲减Drp1和Mdivi-1抑制Drp1在S616位点的磷酸化水平,检测细胞凋亡、ROS、线粒体膜电位和线粒体形态。检测细胞和组织水平Drp1上游基因ROCK1的表达水平,Co-IP实验证明ROCK1和p-Drp1(S616)的相互作用关系。miRNA测序检测脐带MSC-sEVs中富集的miRNA分子,RNAhybrid网站预测其中与ROCK13’UTR端可能存在结合的靶miRNA,荧光素酶报告基因验证miRNA与ROCK1的调控关系。构建miR-8747 mimics和inhibitor,HG/HFSAG配制刺激miR-8747 mimics转染的H9c2细胞或miR-8747 inhibitor转染并进行脐带MSC-sEVs干预的H9c2细胞,检测ROCK1和p-Drp1(S616)表达水平,检测细胞凋亡、ROS、线粒体形态和膜电位。结果:成功分离培养脐带MSC,其表达干细胞特异性标记,并能够诱导形成骨和脂肪细胞。透射电镜观察MSC-sEVs呈典型的圆盘状,大小较均一。纳米颗粒分析仪检测MSC-sEVs粒径中位值在145nm,Western blot检测可见MSC-sEVs表达特异性标记蛋白。在体内,脐带MSC-sEVs能够恢复db/db小鼠心脏功能,增加左室射血分数和左室缩短分数,并降低血清c Tn I表达水平。组织病理学检测表明脐带MSC-sEVs干预恢复心肌细胞和肌纤维形态,减轻炎症,减少心肌纤维化水平,减少心肌8-OHd G表达,减少细胞凋亡。在STZ诱导的大鼠DCM模型中,脐带MSC-sEVs表现出了相似的心肌保护作用。在体外,脐带MSC-sEVs能够促进H9c2细胞增殖,有效减少HG/HF诱导的细胞凋亡,降低细胞ROS产生,并可以促进增殖相关蛋白表达,减少凋亡相关蛋白表达。脐带MSC-sEVs处理抑制db/db小鼠心肌和HG/HF诱导的H9c2细胞线粒体过度分裂,恢复线粒体形态,缓解线粒体膜电位下降。MSC-sEVs干预可以有效降低db/db小鼠心肌组织和HG/HF刺激的H9c2细胞中Drp1和p-Drp1(S616)表达水平,并且能够抑制Drp1向线粒体的转位作用。敲减Drp1或Mdivi-1处理可以缓解HG/HF诱导的细胞凋亡、ROS和线粒体膜电位的下降,促进线粒体形态恢复。ROCK1在db/db小鼠心肌组织和HG/HF刺激的H9c2细胞中高表达,并且与p-Drp1(S616)表达趋势相一致,MSC-sEVs处理能够抑制二者的表达。Co-IP结果显示,ROCK1能够与p-Drp1(S616)结合。根据miRNA测序获取的脐带MSC-sEVs中miRNA的表达谱预测与ROCK1 3’UTR端的结合位点,荧光素酶报告基因显示miR-8747与ROCK1 3’UTR端存在靶向结合。PCR检测表明MSC-sEVs处理明显增加H9c2细胞内miR-8747含量。miR-8747 mimics转染可明显抑制HG/HF诱导的H9c2细胞ROCK1和p-Drp1(S616)表达,缓解细胞凋亡、ROS和线粒体膜电位的下降,促进线粒体形态恢复。miR-8747 inhibitor转染HG/HF刺激的H9c2细胞能够促进心肌细胞ROCK1和p-Drp1(S616)表达,并促进细胞凋亡、ROS产生和线粒体膜电位的下降,脐带MSC-sEVs回补可以抑制上述改变。结论:脐带MSC-sEVs能够通过携载miR-8747,靶向抑制ROCK1/Drp-1轴介导的线粒体分裂,缓解DCM心肌损伤,改善心脏功能。本研究为基于sEVs的无细胞疗法的开发在糖尿病及其并发症治疗中的应用提供了新的实验依据。