第一部分番茄红素在精索静脉曲张大鼠睾丸损伤中发挥抑制作用背景:精索静脉曲张(Varicocele,VC)是常见的男性生殖系统疾病,可能与男性不育、同侧阴囊及其内容物坠胀疼痛不适、睾酮合成及分泌异常有关,是导致男性不育的主要病因之一。对于精索静脉曲张男性不育的治疗,目前尚没有特效的治疗药物,在临床上多为非特异性和经验性应用药物。因此,明确精索静脉曲张导致生育力低下确切的病理机制,寻找新的更为有效的治疗药物,以期改善精索静脉曲张患者生育能力低下,是目前精索静脉曲张性不育症研究领域亟待解决的问题。番茄红素(Lycopene)是一种植物化学物。研究发现,它具有很强的抗炎、抗氧化作用,可以被用于慢性前列腺炎、良性前列腺增生、慢性盆腔疼痛综合征和前列腺癌的辅助药物治疗。但是,番茄红素在精索静脉曲张性不育症中是否能够发挥作用目前尚不清楚。目的:探究番茄红素在精索静脉曲张大鼠睾丸损伤中是否能够发挥作用。方法:本部分研究中,我们首先构建了实验性精索静脉曲张大鼠模型,并通过对大鼠睾丸、附睾组织称重,检测大鼠精子质量及激素分泌情况验证精索静脉曲PLX-4720临床试验张睾丸损伤。随后,为了探究番茄红素对精索静脉曲张大鼠睾丸损伤是否有治疗作用,我们将选取的大鼠分为以下三组:假手术组(NG),精索静脉曲张组(VG),精索静脉曲张+番茄红素60 mg/kg给药组(VLG);培养4周后取材,通过采用ELISA实验、HE染色实验,免疫组化实验以及TUNEL实验等方法进行检测。结果:精索静脉曲张组大鼠的睾丸、附睾重量均减轻,精子密度和活力均降低,精子的畸形率升高;血清中睾酮的含量降低。而番茄红素治疗组大鼠的精子质量和睾酮分泌与精索静脉曲张组大鼠组相比都有明显的改善。随后,在对三组大鼠睾丸组织的HE染色中发现,VLG组大鼠睾丸生精上皮损伤与VG组相比明显好转。TUNEL染色后发现,VG大鼠睾丸生精细胞凋亡明显加重,而VLG组生精细胞凋亡减轻。对三组大鼠睾丸组织进行免疫组化染色PCNA后发现,VG大鼠PCNA明显减少,而VLG组PCNA较VG组明显升高。这表明番茄红素可以降低精索静脉曲张引起的睾丸生精细胞的凋亡,减轻精索静脉曲张对大鼠睾丸生精上皮的损伤。本实验还通过ELIS A实验检测了三组大鼠睾丸组织中炎症因子IL-1 β和IL-2的表达,结果显示,精索静脉曲张大鼠睾丸组织中炎症因子表达升高,而应用番茄红素后,炎症因子IL-1β和IL-2的表达显著减少。通过检测三组大鼠睾丸组织中氧化应激相关因子ROS及SOD的水平发现,番茄红素治疗组ROS水平显著减少,SOD水平增加。表明番茄红素在精索静脉曲张中发挥抗炎、抗氧化作用。结论:综合上述研究结果,番茄红素能够抑制精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡,减轻生精上皮损伤,改善大鼠睾丸的生精功能。第二部分 番茄红素抑制精索静脉曲张缺氧诱导的睾丸损伤机制研究背景:精索静脉曲张所致的不育症可能病因包括阴囊温度升高,氧化应激,睾丸缺氧,代谢物从肾上腺回流,二氧化碳和一氧化氮积聚以及自身免疫等,但是精索静脉曲张导致生育力低下确切的病理机制目前尚不清楚。睾丸缺氧被公认为是精索静脉曲张的重要病理生理特征。大量研究表明,精索静脉曲张诱导的睾丸的低氧环境能引起氧化应激,炎性反应,这会对细胞和组织造成广泛的损伤,影响多种生物学进程,如细胞的增殖、凋亡等,最终引起睾丸生精功能损伤。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的微小非编码RNA,病理条件下,miRNA的异常表达可以参与调控多种疾病,包括精索静脉曲张。差异表达的lncRNA和miRNA可能是预测精索静脉曲张生精功能障碍风险和手术修复效果的潜在生物标志物。前动力蛋白2(Prokineticin 2,PROK2)是一种具有多种生物学功能的分泌蛋白。PROK2可以参与多种病理过程,如炎症、异常的血管新生以及器官发育障碍等。研究者发现PROK2在精索静脉曲张的大鼠中的表达增加,还可以通过诱导精母细胞的凋亡参与大鼠精索静脉曲张的发生过程。提示PROK2与精索静脉曲张的发生有着密切关联。目的:探究番茄红素在精索静脉曲张缺氧诱导的睾丸损伤中发挥抑制作用的具体分子机制。方法:根据前期动物实验的结果,我们发现番茄红素对VC大鼠精母细胞损伤改善比较显著,因此我们选取了小鼠精母细胞GC-2构建了低氧诱导的体外细胞模型,将GC-2细胞分为以下三组:常氧处理组,低氧+DMSO处理组,低氧+番茄红素10μM处理组,细胞培养箱中培养24h后,采用Wetsern blot实验,流式细胞检测技术,CCK-8和EdU细胞增殖实验检测番茄红素对精母细胞的影响。通过miR-Seq检测睾丸中miRNA的改变,然后采用生物信息学分析及qRT-PCR实验等方法,检测了 miR-23a-3p和miR-23b-3p在大鼠睾丸组织和小鼠GC-2精母细胞中的表达情况。随后,我们通过STARBASE数据库预测和Luciferase reporter实验验证PROK2和miR-23a-3p/miR-23b-3p相互作用。进一步的研究中,我们对小鼠GC-2精母细胞给予了低氧刺激,同时分别给予细胞番茄红素、转染miR-23a-3p inhibitor 和 miR-23b-3p inhibitor 处理,通过 qRT-PCR 实验和 Western blot实验检测细胞中PROK2的表达变化情况,最后,通过采用Wetsern blot实验检测三组大鼠睾丸组织中HIF-1 α,NF-κB,VEGF,AKT和p-AKT在蛋白水平的表达变化情况。结果:首先,在体外细胞实验中,对三组GC-2精母细胞进行WesternBlot方法检测细胞凋亡相关蛋白BCL-2、Cleaved Caspase-3的表达。结果显示缺氧状态下GC-2精母细胞BCL2/BAX 比值降低而C-/T-caspase3比值增加,这表明缺氧状态下细胞凋亡增加,而番茄红素可减轻缺氧诱导的精母细胞凋亡。流式细胞技术检测凋亡能力也得到了同样结果。通过cck-8和EdU实验,我们发现番茄红素可以减轻缺氧对GC-2精母细胞增殖的抑制作用。这表明,番茄红素能够促进精母细胞的增殖,抑制细胞凋亡。然后,我们应用miR-Seq检测三组大鼠睾丸组织miRNA的表达谱,其中,miR-23a-3p和miR-23b-3p在精索静脉曲张组表达降低,而番茄红素治疗组表达升高。后续我们通过qRT-PCR实验分别检测三组大鼠睾丸组织和GC-2精母细胞中miR-23a-3p和miR-23b-3p的表达,发现与精索静脉曲张低氧诱导组相比,番茄红素治疗组的大鼠睾丸组织和GC-2精母细胞中miR-23a-3p和miR-23b-3p的表达皆明显升高。接着,为了明确miR-23a-3p和miR-23b-3p在缺氧条件下对小鼠精母细胞增殖活性及凋亡的影响,我们将miR-23a-3p及miR-23b-3p mimics转染GC-2精母细胞,通过流式细胞技术检测GC-2精母细胞的凋亡。结果表明,过表达miR-23a-3p及miR-23b-3p可显著抑制缺氧导致的GC-2精母细胞的凋亡。为了进一步验证miR-23a-3p及miR-23b-3p的抗凋亡作用,我们采用Westernblot检测了凋亡相关蛋白的表达。结果表明,过表达miR-23a-3p及miR-23b-3p显著上调GC-2精母细胞BCL2/BAX的表达,而下调C-/T-caspase3表达。此外,CCK8及EdU实验结果表明,过表达miR-23Cecum microbiotaa-3p及miR-23b-3p可以提高缺氧导致的GC-2精母细胞的增殖活性。上述结果表明miR-23a-3p和miR-23b-3p具有抑制缺氧诱导的GC-2精母细胞凋亡并促进细胞增殖的作用。接着,通过STARBASE数据库预测miR-23a-3p和miR-23b-3p的下游潜在靶点,结果发现,PROK2是miR-23a-3p和miR-23b-3p的共同靶点。Luciferase reporter实验证实了 KD025说明书PROK2是miR-23a-3p和miR-23b-3p下游作用的靶基因。下一步,我们分别检测了三组大鼠睾丸组织中PROK2在mRNA和蛋白水平的表达,结果显示相比于VG组,VLG组大鼠睾丸组织中PROK2在mRNA和蛋白水平的表达量显著减少。细胞实验中,相比于低氧处理组,番茄红素处理组GC-2精母细胞中PROK2在mRNA水平的表达也显著减少。而在番茄红素处理组GC-2精母细胞加入miR-23a-3p inhibitor或miR-23b-3p inhibitor后可以逆转这一抑制作用。最后,我们通过Western blot实验检测三组大鼠睾丸组织HIF-1α,NF-κB,VEGF和p-AKT在蛋白水平的表达变化情况。结果发现,相比于精索静脉曲张组,番茄红素治疗组大鼠睾丸组织中HIF-1α,NF-κB,和VEGF在蛋白水平的表达量减少,而p-AKT在蛋白水平的表达量增加。表明番茄红素抑制精索静脉曲张缺氧条件下大鼠睾丸组织中HIF-1α,NF-κB和VEGF的表达并促进p-AKT的表达。结论:番茄红素通过激活miR-23a-3p/23b-3p/PROK2轴减轻缺氧诱导的精母细胞凋亡,从而改善精索静脉曲张缺氧诱导的睾丸生精功能损伤。此外,HIF-1α/NF-κB/VEGF/AKT轴在番茄红素抑制缺氧诱导的睾丸损伤过程中同样发挥重要作用。我们的研究结果为将来精索静脉曲张性不育症的治疗提供了一个新的治疗药物,对改善精索静脉曲张性不育症患者的生育能力具有重要的临床意义。