目的慢性肾病可以有多种因素造成,例如炎症反应、氧化应激等。CKD会并发肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)。IL-1β是一种常见的促炎症、促进纤维化发生的细胞因子,IL-1β通过结合IL-1受体IL-1R,依赖My D88进而激活NF-κB信号通路,增加转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。TGF-β1是肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(epithelial-myofibroblast transition,EMT)的重要诱导分子,促进肾间质纤维化的发生和发展肾小管间质纤维化。SIGIRR作为IL-1β的负性调控分子,能与IL-1R和其他信号分子如My D88相互作用,从而抑制IL-β/IL-1R介导NF-κB信号通路的活化,在抑制肾内炎症发生有着重要作用。本文主要研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法1.动物模型的研究:(1)为了验证CKD并发RIF中是否与SIGIRR/NF-κB反馈调控机制,且该机制是否与IL-1β诱导的EMT发生有关,我们利用0.2%腺嘌呤饲料和正常饲料喂养分别喂养Sigirr~(-/-)小鼠和Sigirr~(+/+)小鼠12周以构建小鼠慢性肾损及并发RIF模型;生化分析的方法检测各组小鼠肾功能变化;利用H&E染色分析肾脏组织病理变化、通过Masson染色观察肾脏纤维化程度。(2)免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和WB检测肾组织中IL-1β、NF-κB(p65)及其活化的NF-κB(p-p65)的水平变化以及与EMT相关的标记分子表达情况。2.细胞水平的研究(1)为了研究SIGIRR对IL-1β活化的NF-κB是否具有负调控作用,以小鼠的肾小管上皮细胞(mice renal tubular epithelial cells,m RTEC)作为研究的细胞模型。分别利用Sigirr~(-/-)小鼠原代培养Sigirr~(-/-)的m RTEC细胞株(m RTEC/Sigirr~(-/-))以及Sigirr~(+/+)小鼠原代培养Sigirr~(+/+)的m RTEC细胞株(m RTEC/Sigirr~(+/+)),用重组人IL-1β(10 ng/ml)处理细胞,通过Western blot(WB)检测NF-κB(p65)及其活化的NF-κB(p-p65)的变化;(2)为了研究SIGIRR在IL-1β诱导的EMT发生中的作用,利用IL-1β处理m RTEC/Sigirr~(-/-)及m RTEC/Sigirr~(+/+)细胞,利用WB检测与EMT发生有关的标记分子,如:E-钙黏蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)等。结果1.慢性肾病并发肾纤维化动物模型进一步证实,Sigirr的缺失有利于NF-κB的活化并促进慢性肾病小鼠并发肾间质的发生(1)肾功能检测结果显示:与正常饲料喂养组WT小鼠和Sigirr~(-/-)小鼠比较,高嘌呤喂养组WT小鼠和Sigirr~(-/-)小鼠血清尿素氮和肌酐水平升高。H&E染色显示对照组的小鼠肾组织形态及结构正常,在高嘌呤喂养组小鼠肾脏中观察到肾小管扩张、上皮细胞坏死和大量炎性细胞浸润、基底膜增厚且出现肾小球硬化等形式的肾损伤,而且Sigirr~(-/-)小鼠肾脏组织中,炎性细胞浸润、小球充血等病理变化较对照组更明显。Masson染色结果显示:高腺嘌呤饲料喂养组出现蓝色沉积;与对照组肾脏组织比较,高腺嘌呤喂养组小鼠肾脏中胶原沉积CL 318952化学结构显著增加,且Sigirr~(-/-)小鼠肾组织的胶原沉积较Sigirr~(+/+)小鼠更严重。(2)IHC和WB结果显示与正常饲料喂养组WT小鼠和Sigirr~(-/-)小鼠比较,高嘌呤喂养组WT小鼠和Sigirr~(-/-)小鼠的IL-1β及下游Myd88和p-p65表达水平增加,且在Sigirr~(-/-)小鼠中,IL-1β、Myd88和p-P65的增加比Sigirr~(+/+)小鼠更显著。高嘌呤喂养组WT小鼠和Sigirr~(-/-)小鼠的E-cadherin水平降低,TGF-β1以及Vimentin水平增加,且在Sigirr~(-/-)小鼠中,E-cadherin的减少和TGF-β1、Vimentin的增加比SiS63845供应商girr~(+/+)小鼠更为明显。2.SIGRR通过反馈调控IL-1β诱导的m RTEC细胞中NF-κB的活化参与EMT发生。(1)在IL-1β处理细胞之后,m RTEC/Sigirr~(+/+)细胞内p-P6Molecular Biology Reagents5水平在15 min时出现短暂的高峰,随后开始减少,24h时下降到初始水平。(2)较m RTEC/Sigirr~(+/+)细胞而言,WB显示m RTEC/Sigirr~(-/-)细胞p-p65水平增加更为显著。(3)WB结果显示,m RTEC/Sigirr~(+/+)细胞在IL-lβ处理后,上皮细胞标记分子的E-cadherin明显降低,而间质标志物Vimentin明显增加,且在m RTEC/Sigirr~(-/-)细胞中,E-cadherin的减少和Vimentin的增加比m RTEC/Sigirr~(+/+)更为明显。结论1.Sigirr的缺失有利于m RTEC细胞中IL-1β诱导的活化NF-κB信号通路;2.Sigirr基因的缺失有利于活化IL-1β/NF-κB/TGF-β1信号通路,促进肾间质纤维化的发生发展3.SIGIRR可作为未来防治RIF潜在靶点。