免疫应答是机体受到病原入侵后,免疫系统调节生物体的多种生理活动以清除病原,保持内环境动态平衡与相对稳定的过程。免疫应答过程中,免疫细胞尤其是血淋巴细胞的数量及功能会发生动态变化以维持机体免疫稳态。免疫应答前期血淋巴细胞发生快速增殖以有效抵御病原,而一旦病原威胁被清除,血淋巴细胞就会相应减少以防止过度免疫给机体带来损伤。转录因子B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(B lymphocyte induced mature protein 1,Blimp-1)在哺乳动物免疫细胞的发生发育中发挥重要调节作用,但其在调节无脊椎动物血淋巴细胞增殖过程中的功能及作用尚不清楚。本研究以软体动物长牡蛎(Crassostrea gigas)Imidazole ketone erastin为对象,利用生物信息学、分子生物学和细胞生物学等技术手段,鉴定了CgBlimp-1及其下游关键基因CgMyc-A,探究了CgBlimp-1和CgMyc-A对免疫应答过程中血淋巴细胞增殖的动态调控作用,取得的主要研究结果如下:1.长牡蛎CgBlimp-1和CgMyc-A在进化上较为保守从长牡蛎基因组中鉴定出转录因子CgBlimp-1和CgMyc-A。CgBlimp-1基因的开放阅读框含2502个碱基,编码含833个氨基酸的多肽,其蛋白结构域组成高度保守,包含1个N端SET结构域(77-201 aa),5个C端串联的Zn F＿C2H2型锌指结构域(58-580,586-608,614-636,642-664,670-692 aa),其氨基酸序列与美洲牡蛎Blimp-1序列相似度最高,为86.83%;与斑马鱼Blimp-1的序列相似度为32.43%。CgMyc-A基因的开放阅读框含1149个碱基,编码含382个氨基酸的多肽,其蛋白结构域组成较为保守,包含1个N端Myc结构域(5-118 aa)和1个C端HLH结构域(302-354 aa),其氨基酸序列与葡萄牙牡蛎Myc-A序列相似度最高,为98.43%,与小鼠的序列相似度为26.86%。在系统发育树中,CgBlimp-1和CgMyc-A分别与无脊椎动物的Blimp-1和C-Myc成员聚为一支。2.CgBlimp-1和CgMyc-A在不同组织中呈组成型表达,且响应灿烂弧菌刺激利用qRT-PCR技术分别检测了CgBlimp-1和CgMyc-A在长牡蛎不同组织中的m RNA表达水平,发现它们在不同组织和血淋巴细胞中均有表达。CgBlimp-1在鳃中表达水平最高,其次在肝胰腺、唇瓣、外套膜中也有较高表达水平,分别是血淋巴细胞中表达量的20.07倍(p<0.001),13.19倍(p<0.01),6.10倍(p<0.01)和5.21倍(p<0.01)。CgMyc-A在鳃和血淋巴细胞中表达水平较高,分别为外套膜中的2.33倍(p<0.01)和1.89倍(p<0.05),在其他组织中的表达水平未见显著差异。进一步检测发现,CgBlimp-1和CgMyc-A在三类血淋巴细胞亚群中的表达量有显著差异,均在颗粒细胞中表达量最高。检测了灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激后,长牡蛎血淋巴细胞中CgBlimp-1及CgMyc-A在m VP-16供应商RNA水平的表达变化。CgMyc-A在免疫应答早期响应免疫刺激,其m RNA表达量在3 h,12 h,48 h显著升高,分别为对照组的2.19倍(p<0.01),2.05倍(p<0.001)和1.63倍(p<0.01)。CgBlimp-1在免疫应答后期响应免疫刺激,其m RNA水平的相对表达量在24 h,48 h,96 h显著升高,分别为对照组的4.16倍(p<0.05),7.68倍(p<0.01)和2.65倍(p<0.05)。3.CgMyc-A的活性或表达被抑制后血淋巴细胞的增殖活性降低注射C-Myc蛋白的小分子抑制剂10058-F4,检测灿烂弧菌刺激后长牡蛎血淋巴细胞的增殖活性变化,发现实验组长牡蛎总血淋巴细胞中Ed U~+新生血淋巴细胞比例显著降低(对照DMSO组的0.70倍,p<0.001),细胞增殖活性被显著抑制。利用RNAi技术干扰CgMyc-A基因的表达,检测灿烂弧菌刺激后长牡蛎总血淋巴细胞中Ed U~+新生血淋巴细胞比例变化,发现实验组(si RNA-CgMyc-A)中Ed U~+细胞比例显著降低(对照si RNA-NC组的0.82倍,p<0.01),细胞周期蛋白CgCDK-2的m RNA表达水平显著降低,为对照组的0.39倍(p<0.01),Western blot检测CgCyclin B蛋白表达水平变化细胞增殖活性被显著抑制。4.CgBlimp-1的表达能显著阻滞细胞周期,抑制血淋巴细胞的增殖利用RNAi技术干扰CgBlimp-1的表达,采用qRT-PCR技术检测了血淋巴细胞中靶基因CgMyc-A的m RNA表达水平变化,发现CgMyc-A的表达量显著升高(对照组的1.63倍,p<0.05);Western blot检测CgMyc-A蛋白水平变化,结果与m RNA水平变化趋势一致。干扰CgBlimp-1的表达后,造血相关因子CgWnt-1,CgRunx-1,细胞周期相关蛋白CgCDK-2的m RNA表达水平均显著升高,分别为对照组的2.04倍(p<0.001),1.62倍(p<0.05)和1.70倍(p<0.05),炎症因子CgIL17-1,CgIL17-2和CgIL17-4的m RNA表达水平均显著升高,分别为对照组的1.71倍(p<0.05),144.70倍(p<0.01)和1.93倍(p<0.05)。利用流式细胞术检测灿烂弧菌刺激后,血淋巴细胞中不同类群细胞比例及细胞周期的变化。灿烂弧菌刺激24 h后,颗粒细胞占总血淋巴细胞的比例升高(海水组的1.29倍,p<0.01),干扰CgBlimp-1后颗粒细胞占总淋巴细胞的比例持续升高,为EGFP-RNAi组的1.14倍(p<0.05)。CgBlimp-1-RNAi组总血淋巴细胞、颗粒细胞中Ed U~+细胞比例显著升高,分别是对照组的1.56倍(pAbiotic resistance<0.01),1.82倍(p<0.05)。且处于G0/G1期的总血淋巴细胞数量、颗粒细胞数量比例显著下降,分别为对照组的0.81倍(p<0.001),0.67倍(p<0.001),处于G2/M期的血淋巴细胞数量、颗粒细胞数量比例显著上升,分别为对照组的2.77倍(p<0.01),1.97倍(p<0.01)。综上所述,本研究从长牡蛎中鉴定出进化上较为保守的转录因子CgBlimp-1及其下游基因CgMyc-A。它们在颗粒细胞中的表达量较高,且显著响应免疫刺激。在免疫应答后期,CgBlimp-1能抑制CgMyc-A的表达,在G0/G1期阻滞细胞周期进程,抑制血淋巴细胞尤其是颗粒细胞的增殖,促进机体稳态的恢复。研究结果将为进一步解析软体动物免疫应答的动态过程及其调节机制提供参考。