目的:非洲猪瘟病毒严重影响了我国生猪安全,而干扰素发挥的抗病毒作用对抑制非洲猪瘟感染至关重要。干扰素(Interferon,IFN)在抗病毒、抑制肿瘤和免疫调节等方面发挥着重要作用。干扰素α(IFN-α)作为I型IFN的一种,主要参与抗病毒免疫过程;干扰素λ(IFN-λ)是III型IFN,其对抗病毒免疫反应的作用仅限于暴露和感染风险较高的上皮组织,在粘膜感染中。而且通过仓鼠卵巢细胞(Cselleckchem BAY 73-4506hinese Hamster Ovary,CHO)表达系统表达的重组蛋白,它的分子结构和生物学功能与天然蛋白分子最相似,同时具备外源性蛋白表达量较高等优势。单克隆抗体在免疫CP-456773体内实验剂量分析领域发挥着重要作用,极大提升了免疫学检测的特异性和灵敏度。本研究拟构建猪源IFN重组质粒并通过CHO表达系统进行高效表达,从而制备灵敏度高、特异性强的单克隆抗体,为在以后的研究中更好地建立不同IFN分子的检测方法以及建立研究猪病毒感染和免疫过程中不同细胞因子的分泌情况的关键技术平台奠定基础。方法:(1)构建猪源重组干扰素(r Po IFN)质粒:提取猪外周血淋巴细胞总RNA并反转录为c DNA,以Gen Bank中目的基因的序列(Gen Bank登录号:α:NM＿214393.1;λ:NM＿001142837.1)为模板设计引物,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因Po IFN-α和Po IFN-λ,将pc DNA3.1真核表达载体通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切后回收纯化,通过T4连接酶连接目的基因与载体得到重组质粒并测序。(2)CHO表达纯化IFN蛋白;参照Expi CHO~(TM)表达系统操作说明进行复苏、传代、转染和收集纯化,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。(3)单克隆抗体制备:蛋白乳化免疫小鼠,检测阳性血清效价后将脾细胞与SP2/0细胞进行融合并建立间接酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)筛选所需的阳性杂交瘤细胞,亚克隆扩大培养后制备腹水得到单克隆抗体,纯化制备的抗体并进行鉴定。(4)通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)技术检测猪不同部位IFN分子的产生与分布情况。结果:(1)扩增出Po IFN-α和Po IFN-λ两条特异性条带,大小分别为612 bp和630 bp;经过T4连接酶连接成功构建出重组质粒pc DNA3.1-Po IFN-α和pc DNA3.1-Po IFN-λ。(2)通过CHO真核表达系统成功表达并纯化出正确大小的可溶性蛋白,IFN-α大小为20 k Da左右、浓度为1.2 mg/m L,IFN-λ大小为25 k Da左右、浓度为0.86 mg/m L。(3)血清效价检测符合细胞融合要求;建立间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤,通过间接ELISA筛选和5次亚克隆IFN-α得到一株能稳定分泌抗IFN-α蛋白的单克隆细胞株(3c6)、IFN-λ得到一株能稳定分泌抗IFN-λ蛋白的单克隆细胞株(3e8);亚型鉴定二者均为为Ig G1亚型、Ig Gκ轻链;Western-blot显示抗体可以特异识别IFN-α与IFN-λ,抗体纯化后IFN-α效价检测可达1:256000、IFN-λ效价检测可达1:32000。(4)IHC可知在脾脏中可见广泛IFN阳性细胞,且红脾区较多,白脾区、脾小体等相对较少,肝脏中阳性细胞主要集中于中央静脉周围。结论Biogeochemical cycle:(1)成功构建出猪源干扰素重组质粒pc DNA3.1-Po IFN-α和pc DNA3.1-Po IFN-λ。(2)成功表达并纯化出正确大小的可溶性蛋白,且重组蛋白纯度好、浓度高。(3)成功制备出r Po IFN-α和r Po IFN-λ的单克隆抗体,且抗体灵敏度高、特异性强。(4)利用制备的单抗成功在ASFV攻毒猪脏器组织中特异性检测到组织中产生的IFN-α与IFN-λ阳性细胞以及二者在肝脏和脾脏组织中的分布状态。