硫芥(Sulfur Mustard,SM),是糜烂性化学毒剂的代表,其毒性作用强、损伤范围广,有“毒气之王”之称。SM的主要靶器官是皮肤、眼睛和呼吸道,中毒后会引起红斑、水疱、瘙痒和溃疡等多种症状。临床研究表明,多数SM中毒的患者在中毒几年甚至几十年后仍具有类似焦虑,抑郁和认知功能减退等神经损伤症状。前期人们认为SM对神经系统的影响主要是身体其他部位的损伤引起的继发效应,并非由SM直接作用导致。但是相关临床数据、体内外实验研究表明SM能够对神经系统产生损伤,降低动物神经细胞存活率,但确切的毒性作用以及毒性机制目前仍不清楚,SM抗毒药物的研究亦严重不足。由于神经系统的特殊性,受供体组织来源及伦理学的限制,直接从神经组织分离培养原代人神经细胞难以实现,因此缺乏S确认细节M对人源神经细胞的研究数据。神经细胞多为增殖不活跃或终末分化的细胞,且具有多种类型。那么SM是否会影响增殖不活跃的人源神经细胞的活性?对不同阶段或类型的神经细胞的影响是否相同?SM对神经细胞损伤的毒性机制是什么?目前尚不清楚。临床上中毒患者的神经损伤症状是SM急性期毒性的延续,还是后续逐渐发展形成?目前也尚不清楚。人诱导性多能干细胞(hiPSC)是将人的体细胞经过重编程技术得到的一种携带人体遗传信息的多能干细胞。hiPSC的出现为研究化学毒剂神经损伤提供了较为理想的人源细胞。目前已经可以将hiPSC诱导分化为多种神经细胞亚型,应用于疾病研究和药物开发过程等多个方面,尤其是在药物神经毒性和有效性的评价中表现出巨大的应用潜力。通过加入特定的诱导因子可将hiPSC定向诱导分化为神经干细胞(NSC)和Neuron,从而得到不同阶段的神经细胞。人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)是一种永生化神经细胞,其形态、生理生化特征与人体正常神经元相似程度高,被广泛应用于神经系统疾病的相关研究。因此本课题将hiPSC、hiPSC源NSC和hiPSC源NCompound C浓度euron作为不同阶段的神经细胞,将SH-SY5Y作为另一种不同类型的神经细胞,建立SM神经细胞染毒模型,研究SM对不同阶段和类型神经细胞的毒性作用及毒性机制。另外通过给予动物皮下注射SM的方式,建立动物染毒模型,动态研究SM对动物神经系统的影响。本研究将为建立SM神经损伤人源化模型、深入理解中毒机制及抗毒药物研究提供依据,具有重要的理论与现实意义。一、基于人诱导性多能干细胞的硫芥神经细胞毒性研究将不同浓度的SM溶液加入到不同阶段和类型的神经细胞中(hiPSC染毒浓度:0.001,0.01,0.1,0.5,1.0,10,100,200 μmol·L-1;hiPSC 源 NSC 和 Neuron 以及 SH-SY5Y染毒浓度:0.1,1.0,10,50,100,200,400,800 μmol·L-1),另外以 0.2%无水乙醇为溶剂对照。与细胞作用30min后除去,之后继续培养24h,建立SM神经细胞损伤模型。从细胞融合率和形态、细胞活力和细胞增殖方面研究SM对不同阶段和类型神经细胞的毒性。1.硫芥对不同阶段和类型神经细胞融合率和细胞形态的影响为了研究SM对神经细胞融合率和形态的影响,在SM染毒前后24 h采用IncuCyte ZOOM活细胞动态成像分析仪监测细胞融合率和形态的变化。结果显示,与对照组相比,hiPSC源Neuron和SH-SY5Y的800 μmol·L-1组细胞融合率在SM染毒后即发生明显变化。之后随着时间延长和染毒浓度增加融合率逐渐降低,细胞原有形态逐渐改变,细胞核皱缩,形态变圆,细胞碎片增多。hiPSC及hiPSC源NSC的细胞融合率和细胞形态的变化在SM染毒后约6～8h开始出现,之后随着时间延长和染毒浓度增加融合率逐渐降低,形态变化主要表现为细胞皱缩变圆、形态逐渐模糊、细胞碎片增多。上述结果表明SM能够时间和浓度依赖性地降低神经细胞的融合率,影响细胞正常形态结构。SM毒性在不同细胞中出现的时间不同,也说明不同细胞对SM毒性的敏感性不同。2.硫芥对不同阶段和类型神经细胞活力的影响为了研究SM对神经细胞活力的影响,在SM染毒24h后,采用CCK-8法检测各组细胞在450nm波长处的吸光度值(OD450nm)并计算细胞存活率;采用试剂盒检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放量;采用Calcein-AM/PI荧光染色法统计死细胞比例。结果显示,与对照组相比,SM染毒24h后能够浓度依赖性地降低hiPSC、hiPSC源NSC和Neuron以及SH-SY5Y的OD450nm值。SM对细胞的半数抑制浓度分别为0.17、11.72、18.78和15.92 μmol·L-1。SM能够引起细胞的LDH释放量逐渐增加,死细胞比例逐渐上升。上述结果表明SM能够浓度依赖性的降低hiPSC、hiPSC源NSC、hiPSC源Neuron和SH-SY5Y的细胞活力。hiPSC对SM的毒性最为敏感,hiPSC源NSC和Neuron以及SH-SY5Y对SM毒性的敏感性相近。SM能够损伤神经细胞膜结构,显著降低神经细胞存活率,最终引起大量细胞死亡。3.硫芥对不同阶段和类型神经细胞增殖能力的影响为了研究SM对神经细胞增殖能力的影响,在SM染毒24 h后,采用EdU荧光染色法检测细胞EdU阳性比例。结果显示,与对照组相比,随着SM染毒浓度增加,hiPSC、hiPSC源NSC和Neuron以及SH-SY5Y细胞中EdU阳性细胞比例均逐渐减小。表明SM能够显著降低神经细胞的增殖能力。本部分研究表明:SM能够浓度依赖性地降低神经细胞的细胞活力,SM对hiPSC的损伤最严重,对hiPSC源NSC和Neuron以及SH-SY5Y的损伤程度接近。但不同细胞的毒性损伤表现有所差异。SM对hiPSC和NSC的损伤主要表现较为一致,即降低细胞增殖能力,导致死细胞比例增加,但对细胞膜的损伤程度较小。SM对增殖不活跃的Neuron的损伤与NSC和SH-SY5Y的其损伤主要表现为破坏细胞膜结构,增加死细胞比例,降低细胞增殖能力。二、基于人诱导性多能干细胞的硫芥神经细胞毒性机制研究为了进一步研究SM对神经细胞损伤的毒性机制,从SM产生细胞毒性的物质和效应两个方面开展研究。采用上述SM对神经细胞的染毒方法,在24 h后检测神经细胞内DNA双链断裂标志物γ-H2A.X含量,细胞内SM与DNA的加合物的种类,细胞内NAD+/NADH、ATP和活性氧(ROS)的含量,以及细胞糖酵解和氧化磷酸化水平。研究DNA损伤、能量代谢和氧化应激在SM神经毒性中的作用,并分析在不同阶段和类型的神经细胞中这些机制的变化是否一致。1.硫芥对不同阶段和类型神经细胞DNA的影响为了研究SM对神经细胞DNA的影响,在SM染毒24 h后,首先采用免疫荧光法检测神经细胞中DNA双链断裂标志物γ-H2A.X的含量,之后采用超高效液相色谱-质谱联用检测SH-SY5Y细胞中的SM-DNA加合物的种类。结果显示,与对照组相比,SM能够浓度依赖性增加hiPSC、hiPSCPediatric emergency medicine源NSC和Neuron以及SH-SY5Y细胞内的γ-H2A.X含量。DNA加合物的检测结果显示,在SM 10 μmol·L-1染毒的SH-SY5Y细胞中检测到2种主要的SM-DNA加合物:鸟嘌呤的N7位单加合物和双链加合物。上述结果表明SM进入神经细胞后,能够与细胞内的DNA加合,可能导致神经细胞DNA双链断裂增加,引起DNA损伤。2.硫芥对不同阶段和类型神经细胞能量代谢的影响为了研究细胞能量代谢在SM神经毒性中的作用,在SM染毒24 h后,采用NAD+/NADH和ATP试剂盒检测细胞内NAD+/NADH和ATP的含量变化;采用Seahorse细胞代谢呼吸动态分析仪检测细胞糖酵解和氧化磷酸化水平的变化。结果显示,与对照组相比,SM能够浓度依赖性地降低hiPSC源NSC和SH-SY5Y细胞内NAD+/NADH和ATP的含量,且NAD+/NADH含量的减少程度高于ATP。hiPSC源NSC和SH-SY5Y的基础糖酵解水平、糖酵解能力最大值和非糖酵解酸化水平均随着SM染毒浓度增加逐渐降低;细胞基础呼吸水平、最大呼吸能力以及ATP生成能力也随SM染毒浓度增加而逐渐降低。hiPSC的检测结果显示,随着SM染毒浓度增加,细胞内NAD+/NADH的含量逐渐降低,而ATP含量逐渐增加。细胞的基础糖酵解水平、糖酵解能力最大值和非糖酵解酸化水平随SM染毒浓度增加逐渐增加;细胞基础呼吸水平、最大呼吸能力以及ATP生成能力随SM染毒浓度增加逐渐降低。上述结果表明,SM能够导致hiPSC源NSC和SH-SY5Y细胞的糖酵解水平和线粒体氧化磷酸化水平逐渐降低,细胞内能量相关物质NAD+/NADH和ATP含量逐渐减少。SM导致hiPSC的细胞糖酵解水平增加,氧化磷酸化水平降低,细胞内NAD+/NADH含量减少,而ATP含量增加。提示SM能够引起不同阶段和类型神经细胞的能量代谢紊乱。3.硫芥对不同阶段和类型神经细胞内活性氧含量的影响为了研究氧化应激在SM神经毒性中的作用,在SM染毒24 h后,采用试剂盒检测细胞内ROS平均荧光强度的变化。结果显示,与对照组相比,随着SM染毒浓度的增加,hiPSC、hiPSC源NSC和Neuron细胞内ROS的平均荧光强度逐渐降低,SH-SY5Y细胞内ROS的平均荧光强度逐渐增加。上述结果表明SM染毒后引起hiPSC、hiPSC源NSC和Neuron氧化应激水平降低,SH-SY5Y氧化应激水平增加。本部分研究表明:SM对增殖不活跃的神经细胞具有显著毒性的原因,一方面可能与DNA加合物形成引起的DNA损伤有关,另一方面SM能够通过其他效应引起细胞损伤,如细胞能量代谢紊乱和氧化应激等。SM对神经细胞损伤的几种机制在终末分化的神经元中同样存在,也表明了 SM不仅靶向增殖活跃的细胞,对增殖不活跃的细胞同样具有毒性损伤。三、硫芥对动物神经系统的影响临床研究发现SM对神经系统的影响可持续多年,有明显的长期效应,那么这种长期效应是SM未恢复的急性损伤效应,还是后续逐渐产生的?目前尚不清楚。本部分采用背部皮下注射方式给予小鼠20mg/kg SM,建立SM中毒损伤模型。通过新物体识别实验、旷场实验、悬尾实验和转棒实验,动态观察在中毒两周和两个月后,SM对小鼠神经系统的影响。实验结果显示,在SM中毒两周和两个月后,与溶剂对照组相比,SM组小鼠在旷场中运动的总距离以及进入旷场中心区域的时间和距离、在新物体识别实验中学习训练1h和24 h后对新物体的偏好指数均有降低趋势,但无显著性差异。悬尾实验中SM组小鼠的不动实验,以及转棒实验中在转棒上的停留时间与溶剂对照组相比均无显著性差异。表明在中毒两周和两个月后,20mg/kg SM并未对小鼠焦虑、抑郁情绪、认知能力和神经肌肉功能产生明显影响。提示临床上的神经症状可能不是未恢复的急性期损伤效应,可能是后期逐渐产生的神经损伤,后续也仍需要进行长期动态检测观察SM对神经系统损伤。综上所述:1.本课题建立了一种基于人诱导性多能干细胞和人神经母细胞瘤细胞的SM染毒模型,能够从细胞活力、死细胞比例、LDH释放量和细胞增殖能力方面很好地反映神经细胞的毒性反应,为后续毒性机制研究以及治疗药物筛选提供良好的细胞模型。2.SM对不同阶段和类型的人源神经细胞的毒性有差异,对hiPSC的毒性最严重。3.SM对增殖缓慢的神经细胞具有直接毒性作用,其毒性机制可能与DNA损伤,氧化应激和能量代谢紊乱有关,详细的神经毒性机制仍需要进一步深入研究。4.SM对神经系统的损伤可能不是未恢复的急性期效应,而可能是后期逐渐产生的损伤效应。