黄精是我国一味传统的补益类中药材,2020版《中国药典》收载的药用黄精来源于百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.和多花黄精 Hua 的干燥根茎,具有补气养阴,健脾,润肺,益肾的传统功效。黄精多以炮制后入药,传统经验认为炮制的主要目的是降低刺激性和增强疗效。目前黄精炮制品优于生品的现代机理研究存在不足,缺乏黄精炮制过程中的整体化学变化研究,黄精发挥补益作用的主要药效部位不明确,药典规定的黄精唯一质控成分多糖在炮制前后的化学结构和药理活性变化也少有研究。基于上述黄精炮制研究存在的科学问题和不足,本文开展了以下研究:一、黄精炮制前后的药理作用比较研究选择大鼠脾肾两虚模型进行黄精炮制前后补益作用比较研究。本研究检测了脾虚和脾肾两虚阶段各组大鼠在下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA),性腺轴(HPG),甲状腺轴(HPT),免疫系统、消化系统和氧化应激方面的血清生化指标Brain-gut-microbiota axis,并比较了各组脏器指数和病理切片。结果表明黄精炮制品调节脾肾两虚大鼠GAS(胃泌素)、MTL(胃动素)、IL-6(白细胞介素-6)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)和MDA(丙二醛)水平的作用比生品更强,黄精炮制品比生品更有利于脾肾两虚大鼠受损脾脏和睾丸的恢复,炮制品组大鼠的病理组织比生品组更接近于正常组。二、整合糖组学和代谢组学研究黄精炮制过程化学本研究通过整合代谢组学和糖组学,阐明了黄精炮制过程中的整体化学变化。研究内容和实验设计如下:第一,制备了炮制0h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10h、12h、14h、16h和18h的黄精饮片作为研究对象,根据电子眼和多糖含量数据判断黄精炮制化学研究的时间阶段。第二,采用UPLC-QTOF-MS/MS测定了不同炮制时间黄精饮片的非糖小分子、单糖和寡糖,同时采用多种色谱技术对炮制过程中的黄精多糖进行了定性和定量化学表征。采用柱前衍生化-高效液相色谱法-光电二极管阵列检测器(PMP-HPLC-PDA)表征黄精炮制过程中多糖的单糖组成变化;采用高效凝胶渗透色谱-示差检测器(HPGPC-RID)测定黄精炮制过程中多糖的分子量变化;采用紫外(UV)检测器检测黄精炮制过程中多糖的基本理化性质。第三,整合代谢组学、糖组学和多变量统计分析,从黄精非糖小分子、单糖和寡糖中筛选出不同炮制阶段的差异代谢物,并对不同炮制时间黄精多糖的各化学参数进行了比较分析。本研究应用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,对黄精炮制过程中的非糖小分子、低聚糖和单糖进行了鉴定分析,共鉴定出了 83种化合物。PCA分析结果表明,黄精炮制大致可以分为三个阶段,即生品(0h)、炮制中期(1-6h)和炮制后期(8-18h)。PLS-DA模型进一步从三个不同炮制阶段的黄精样本组中筛选出了 20个差异标记物以区分不同炮制阶段的黄精。黄精多糖的化学转化阶段与黄精非糖小分子、低聚糖和单糖一致。炮制过程中黄精多糖的理化性质发生了明显变化,粗多糖中多糖含量下降,糖醛酸和糖蛋白含量上升。从单糖组成的角度看,不同炮制时间的黄精多糖主要由Man(甘露糖)、Rib(核糖)、GalA(半乳糖醛酸)、Mirdametinib细胞培养Glc(葡萄糖)、Gal(半乳糖)和Xyl(木糖)等6种单糖组成,但各单糖所占比例有较大差异。从分子量角度看,炮制品多糖产生了一部分高分子量多糖和一部分低分子量糖。黄精炮制过程涉及水解、氧化分解、脱水、美拉德反应和聚合反应等多种化学机制,引起黄精中多种化学成分质和量的变化。三、基于脾肾两虚模型筛选黄精发挥补益作用的有效部位本研究基于大鼠脾肾两虚模型筛选了黄精发挥补益作用的有效部位,比较了黄精小分子、低聚糖和Dibutyryl-cAMP供应商多糖对脾肾两虚大鼠的血清生化指标和脏器指数的调节作用,观察并比较了各组大鼠的病理切片。结果表明,黄精糖类成分补益作用优于小分子类成分,多糖>低聚糖>小分子,所以后续研究应将多糖作为黄精研究的重点部位。黄精对脾肾两虚大鼠消化功能、免疫功能、抗氧化应激功能的调节效果显著优于对甲状腺轴(HPT),下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)和性腺轴(HPG)的调节作用,所以后续多糖的活性研究可以从增强免疫和抗氧化等方面进行。四、黄精炮制前后均一分子量多糖的分离纯化和化学比较研究本研究采用阴离子交换色谱和凝胶色谱相结合的方法,分离得到了 5个均一分子量多糖;采用HPGPC-RID法表征了黄精炮制前后5个多糖的分子量变化;进一步采用离子色谱法检测了 5个均一分子量多糖的单糖组成。结果表明,PCP-1和PCP-2分子量范围为2000-3000 Da,PCP-3,PCP-4和PCP-5分子量范围为150-250kDa。生品多糖PCP-1主要由Fru和Glc组成,其中Fru和Glc所占比例可达到93.8%。黄精炮制品多糖PCP-2的单糖组成更复杂,由Gal、Glc、Rib、Fru、Ara和Man这6种单糖组成,其中Gal所占比例最高,可达到57.8%。高分子量酸性多糖PCP-3、PCP-4和PCP-5主要由GalA、Gal和Ara组成。由以上结果可知,高温炮制致使黄精多糖的理化性质产生了很大变化。五、黄精多糖对RAW 264.7细胞的免疫调节作用本实验选择RAW 264.7细胞进行黄精多糖的体外免疫活性研究,通过检测各组细胞的增殖能力、吞噬活性、NO、IL-1β和TNF-α的分泌量,研究不同炮制阶段粗多糖、炮制前后均一分子量黄精多糖以及低聚糖的药理活性。结果表明,高分子量酸性多糖PCP-3,PCP-4和PCP-5促进细胞分泌NO的活性比低分子量中性多糖PCP-1和PCP-2更强,推测高分子量多糖的免疫刺激能力比低分子量多糖更强,促使RAW264.7细胞产生了更强的免疫应答。多糖比低聚糖促进细胞增殖和分泌NO的能力更强。推测黄精各组分多糖的活性差异可能与两方面原因有关,一方面与多糖分子量差异有关,另一方面与中性多糖和酸性多糖刺激细胞产生免疫应答的能力不同有关。综上所述,本研究明确了黄精炮制品对脾虚和脾肾两虚大鼠的防治效果比生品更好;整合糖组学和代谢组学,将黄精非糖小分子和碳水化合物纳入了整体化学成分表征的研究范围,探究了黄精不同炮制阶段的化学变化,揭示了黄精炮制过程中涉及的化学机制;证实了黄精发挥补益作用的主要有效部位为多糖;从黄精生品和炮制品中分离得到了 5个均一分子量多糖并进行了化学比较研究;比较了不同炮制阶段粗多糖和炮制前后均一分子量多糖以及低聚糖对RAW 264.7细胞的免疫调节活性。本文为黄精的炮制机理研究提供了数据支撑和科学依据。