间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新和多谱系分化能力的未分化细胞。骨髓MSCs与骨质疏松症(osteoporosis,OP)的发生发展密切相关。OP是一种衰老相关疾病,其主要特征是成骨细胞的数量减少。成骨细胞来源于骨髓MSCs,故OP主要是由于骨髓MSCs成骨分化能力下降所致。有研究表明,诱导MSCs分化为成骨细胞能够提高骨矿物质的密度,从而防止OP恶化。然而,体外连续培养过程中会导致MSCs逐渐发生衰老,其成骨分化潜能也逐渐减弱,严重制约其在基础研究和临床疾病治疗中应用。因此,阐明调控干细胞衰老和成骨分化的分子机制,对于改善干细胞功能和治疗骨质疏松症具有重要意义。端粒磨损和线粒体功能障碍是衰老的重要标志,两者之间存在“Crosstalk”调控。端粒缩短不仅能引起细胞衰老和线粒体功能障碍,还与干细胞分化能力降低有关。反之,抑制线粒体ROS的产生也能减轻细胞衰老所致的端粒磨损和端粒DNA损伤。此外,线粒体是干细胞成骨分化的主要能量来源,线粒体ATP合成增加有利于骨折的愈合。在前期工作中我们发现,衰老MSCs的成骨分化能力明显降低,转录组测序结果揭示衰老MSCs中端粒相关基因显著下调,其中端粒shelterin复合物的核心成分TINF2 下调尤为显著。由此我们提出问题,衰老MSCs成骨分化能力减弱是否与TINF2表达下调有关?结合KEGG Pathway富集分析结果,NF-κB信号通路在衰老MSCs中明显下调,并且NF-κB信号通路与干细胞衰老、成骨分化以及线粒体功能之间关系密切。我们推测,端粒相关基因TINF2可能通过介导线粒体功能影响NF-κB信号通路,进而参与调控MSCs衰老和成骨分化。目的:筛选出衰老MSCs中变化显著的端粒相关差异基因,明确差异表达基因的变化对MSCs衰老及成骨分化的影响,进一步探究其机制,既为延缓干细胞衰老、促进成骨分化提供新思路和新靶点,也为临床治疗骨质疏松症提供实验依据。方法:1.选用出生1～2月健康雄性Wistar大鼠,采用全骨髓贴壁法提取原代MSCs,然后通过连续体外传代培养得到早代次MSCs(early passage MSCs,EPMSCs)和晚代次MSCs(late passage VX-661纯度MSCs,LPMSCs)。通过细胞形态学观察,细胞表面积、细胞长宽比、SA-β-gal活性、衰老相关因子p16INK4amRNA表达等衰老相关指标的检测,构建MSCs体外复制性衰老模型。2.采用转录组测序检测年轻和衰老MSCs的基因表达谱,筛选出具有显著变化的端粒相关差异表达基因,其中TRF1和TRF2相互作用核蛋白2(TRF1 and TRF2interactingnuclearprotein2,TINF2)是变化最为显著的差异基因,进一步通过RT-qPCR和Western Blot检测衰老MSCs中TINF2的表达水平。3.通过慢病毒感染获得TINF2敲减(sh-TINF2)或过表达(LV-TINF2)的MSCs(在年轻MSCs中敲低TINF2表达,在衰老MSCs中过表达TINF2),进一步探究TINF2表达的变化对MSCs衰老和成骨分化的影响。分别测定衰老相关指标(细胞形态、SA-β-gal活性及p16INK4amRNA表达)和成骨分化能力(茜素红染色,Western Blot检测成骨分化标志物Runx2表达)。此外,在年轻MSCs中通过慢病毒感染过表达TINF2,检测其对细胞衰老和成骨分化的影响。4.通过慢病毒感染获得TINF2敲减或过表达的MSCs,探讨TINF2表达的变化对端粒和线粒体功能的影响。分别进行端粒功能(端粒长度和端粒损伤标志物γH2AX的表达)和线粒体功能(ATP含量和ROS水平)的检测。5.在TINF2敲减或过表达的MSCs中,通过Western Blot检测NF-κB信号通路表达水平的变化。然后在TINF2敲减的MSCs中激活NF-κB信号通路(加入NF-κB信号通路的激活剂PMA),探讨其对线粒体功能及细胞衰老的影响。结果:1.与EPMSCs相比,LPMSCs呈铺展、细胞边界模糊等形态学变化,细胞长宽比明显降低,表面积显著增加,SA-β-gal阳性率升高,衰老相关因子p16INK4a mRNA的表达上调。后续研究将以EPMSCs为年轻MSCs,LPMSCs为衰老MSCs。2.转录组学分析结果显示,与年轻MSCs相比,衰老MSCs中共有3188个(上调918个,下调2270个)差异表达基因,其中有11个Enzyme Inhibitors变化最显著的端粒相关差异基因。GO和KEGGPathway富集分析结果显示,端粒维持、双链断裂部位和端粒酶RNA结合等在衰老MSCs中下调;NF-κB信号通路、凋亡和非同源末端连接等在衰老MSCs中下调。在11个端粒相关差异基因中,Parp1和TINF2变化最为显著。由于TINF2是端粒复合物中的核心成分,对维持端粒功能起重要作用,故后续我们以TINF2为研究靶点。RT-qPCR和Western Blot也进一步证实TINF2在衰老MSCs中显著下调,与转录组测序结果一致。3.敲减TINF2使年轻MSCs呈衰老形态学特征,细胞表面积增大而长宽比减小,SA-β-gal阳性率及p16INK4amRNA表达增高,同时,骨基质钙盐沉积减少,成骨分化标志物Runx2蛋白表达下调。TINF2过表达使衰老MSCs细胞由铺展、不规则变为长梭形,边界变清晰,细胞表面积减小而长宽比值增大,SA-β-gal阳性率及p16INK4amRNA表达降低,骨基质钙盐沉积增多及Runx2蛋白表达上调。此外,在年轻MSCs中过表达TINF2对细胞衰老无明显影响,但使其成骨分化能力显著增强。4.敲减TINF2后,MSCs的端粒长度显著缩短,端粒损伤标志物yH2AX表达明显增强,同时线粒体ROS水平增加而ATP产生减少,即敲减TINF2使MSCs端粒功能降低,并且削弱了 MSCs线粒体功能。过表达TINF2后,MSCs的端粒长度明显延长,端粒损伤标志物yH2AX表达减弱,同时线粒体ROS水平减少而ATP产生增多,即过表达TINF2增强了 MSCs端粒功能,并且改善了 MSCs线粒体功能。PCI-32765说明书5.TINF2敲减后,p-NF-κB p65的蛋白表达水平显著下调,而NF-κB p65表达水平两组间无明显差异;TINF2过表达后,p-NF-κB p65蛋白表达水平显著上调,而NF-κB p65表达水平两组间也无统计学差异。提示敲减TINF2能够抑制NF-κB信号通路,而过表达TINF2则激活NF-κB信号通路。此外,在TINF2敲减的MSCs中加入NF-κB信号通路的激活剂PMA后,细胞内ROS含量明显降低,而ATP含量显著增高,衰老MSCs细胞由铺展、不规则变为长梭形,边界变清晰,细胞表面积减小而长宽比值增大,SA-β-gal阳性率及p16INK4amRNA表达降低,说明激活NF-κB信号通路能明显改善TINF2敲减所致的线粒体功能降低并延缓MSCs衰老。结论:1.在衰老MSCs中,端粒相关基因TINF2表达降低。2.敲减TINF2能够促进MSCs衰老、抑制其成骨分化,而过表达TINF2则能抑制MSCs衰老、促进其成骨分化。3.TINF2介导端粒和线粒体功能通过NF-κB信号通路调控MSCs衰老及成骨分化。