伪狂犬病毒(Pseudorabies Pidnarulex价格virus,PRV)又称为猪疱疹病毒I型,属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科和水痘病毒属。PRV传播范围十分广泛,主要的宿主是猪,感染后可引起一系列的严重疾病(以中枢神经系统损伤为主),给养猪业带来巨大的经济损失。目前由于PRV变异株的出现使得传统疫苗的免疫保护能力显著降低。因此,开发针对PRV感染的治疗药物具有重要意义。c GAS/STING信号通路作为细胞内主要的DNA传感器,可以识别PRV感染,并触发天然免疫应答反应,诱导I型干扰素产生,PRV可以抑制该通路从而实现免疫逃逸。黄酮类化合物具有多种药理活性,是潜在抗疱疹病毒药物的重要来源。本研究通过评价黄酮类化合物抗PRV活性以及对c GAS/STING通路相关因子的调节作用,筛选得到候选化合物,然后通过体内和体外验证该化合物对c GAS/STING信号通路的调节作用。主要研究内容如下:1.黄酮类化合物调节c GAS/STING信号通路的筛选采用CCK-8法检测25种黄酮类化合物对PK-15细胞的半数有毒浓度CC_(50),以及对PRV的抑制率并计算半数抑制浓度IC_(50);结果显示,经过CCK-8检测山奈酚(IC_(50)=25.57μM)、黄芩素(IC_(50)=291.47μM)、水飞蓟宾(IC_(50)=203.26μM)、杨梅素(IC_(50)=23.24μM)、木犀草素(IC_(50)=36.87μM)、二氢杨梅素(IC_(50)=161.34μM)、柚皮素(IC_(50)=269.43μM)和甘草素(IC_(50)=323.09μM)表现出良好的抑制PRV活性。通过荧光定量PCR法检测上述抗病毒活性化合物对PRV感染后c GAS/STING信号通路相关基因(c GAS、STING、IRF3、IFN-β)m RNA表达水平的影响。结果显示,PRV能显著抑制该通路细胞因子的表达(P<0.01);柚皮素、黄芩素、木犀草素、杨点击此处梅素能够显著促进c GAS的m RNA表达水平(P<0.001);黄芩素(P<0.01)、木犀草素(P<0.001)、杨梅素(P<0.001)可显著提高STING的m RNA水平;杨梅素能提高IRF3和IFN-β的m RNA表达水平(P<0.001)。以上结果初步显示,杨梅素可能调节c GAS/STING通路抑制PRV的感染。2.杨梅素对PRV感染细胞c GAS/STING信号通路调节作用通过检测细胞内第二信使环鸟腺苷酸(c GAMP)含量、c GAS/STING信号通路中相关基因和效应因子的m RNA表达水平、IRF3磷酸化入核情况以及IRF3和p-IRF3蛋白表达的影响,以确定杨梅素对c GAS/STING信号通路的激活情况。结果显示,杨梅素能极显著提高c GAMP含量(P<0.001);在病毒感染后2 h、6 h和12 h上调通路相关基因(c GAS、STING、TBK1、IRF3和IRF7)、通路效应因子(IFN-β)以及相关干扰素刺激基因(ISG54和ISG56)的m RNA表达水平(P<0.01);免疫荧光试验表明杨梅素能够增加p-IRF3蛋白入核(P<0.01);Western blot试验显示杨梅素能提高p-IRF3蛋白的表达水平(P<0.01)。以上结果说明,PRV感染后杨梅素能够激活c GAS/STING信号通路,从而抑制PRV增殖的作用。3.杨梅素调节PRV感染后c GAS/STING信号通路的确证通过在HEK-293T细胞上过表达c GAS-HA和STING-flag,构建单一c GAS/STING通路细胞模型,采用Western blot方法检测c GAS-HA、STING-flag、TBK1、IRF3以及p-IRF3蛋白的表达,利用双荧光素酶报告基因检测系统检测IFN-β启动子的表达水平。结果显示,在293T细胞中杨梅素可以通过提高c GAS、STING以及下游蛋白TBK1、p-IRF3(P<0.01)的表达促进通路的激活,并进一步提高效应因子IFN-β的转录合成(P<0.001)。最后在PRV感染Enfermedad inflamatoria intestinal小鼠体内,检测杨梅素处理后各脏器组织中c GAS/STING信号通路相关基因及蛋白的表达情况,并测定IFN-β的生成量。结果显示,杨梅素可以在PRV感染小鼠体内上调上述c GAS/STING通路相关基因转录水平、提高TBK1和p-IRF3蛋白的表达(P<0.001),促进IFN-β的生成。以上结果进一步确证杨梅素对PRV感染后c GAS/STING信号通路的调节作用。综上,本研究证实黄酮类化合物杨梅素能激活被PRV抑制的c GAS/STING信号通路,提高机体的天然免疫应答反应从而抑制PRV的感染,研究结果阐明了杨梅素抗PRV复制的作用机制,为从黄酮类化合物中寻找PRV感染的防控方法提供了新思路。