研究背景:卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)在所有妇科恶性肿瘤中死亡率最高,其5年生存率不足50%,严重危及女性健康。上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)是其中最主要类型,占比高达90%,因其发病率与病死率持续居高不下使其相关机制研究在医学领域备受关注。因此,深入研究EOC的发生发展机制,寻找新的药物作用靶点和治疗策略具有重大研究意义。UBP43是去泛素化酶(Deubiquitylating Enzymes,DUBs)家族中的重要一员,因其在稳定下游蛋白底物中的作用而广为人知。UBP43的失调已被证实与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。然而,在不同类型肿瘤中,UBP43所发挥的促进或抑制作用存在差异。因此,通过相关研究来明确UBP43在特定癌症类型中所发挥的作用是十分必要的。目前,UBP43在EOC发生发展过程中所发挥的作用尚未见报道。前期课题组通过检索相关数据库发现:与肺癌、肝癌等其他20余种肿瘤相比,UBP43在卵巢癌中尤为高表达,且UBP43和β-catenin之间可能存在重要关联。值得注意的是,β-catenin通路是一条已经被充分证实的促进肿瘤恶性表型的关键通路。然而,关于UBP43是否能够通过调控β-catenin信号通路发挥作用尚未见报道。本研究则以此为切入点,提出研究假说:“UBP43调控β-catenin信号通路可能是影响EOC发展新机制,且对β-catenin通路的调控作用可能与UBP43所具有的去泛素化活性及稳定下游蛋白底物的功能特性有关。”研究目的:本研究旨在探讨UBP43对EOmicrobiota dysbiosisC细胞生物学行为的影响,揭示UBP43通过β-catenin信号通路影响EOC进展新机制,为EOC提供潜在治疗新靶点,为将来UBP43特异性抑制剂的探索和开发提供理论依据。研究方法:1.分析UBP43与EOC的临床相关性。通过检索TNMplot数据库以及10对EOC临床样本(癌及癌旁)的q RT-PCR和Western blot实验检测明确UBP43在EOC组织中的表达情况。应用Kaplan-Meier-Plotter数据库分析UBP43的表达与的卵巢癌临床预后相关性。2.UBP43对EOC细胞生物学行为产生的影响。通过Western blot实验检测UBP43在五种EOC细胞系(OVCAR-3、Caov-3、TOV-112D、A2780、SK-OV-3)及正常卵巢上皮细胞系(HOSEpi C)中的蛋白本低表达量。应用慢病毒针对A2780和TOV-112D两株细胞同时构建UBP43敲低和过表达稳转细胞系。通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞术、Transwell实验检测UBP43的敲低和过表达对EOC细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过Western blot进一步检测UBP43的敲低和过表达对G2/M期相关蛋白Cyclin B1和CDK1表达的影响。最后,应用Western blot实验检测UBP43敲低和过表达对上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)、迁移、侵袭相关基因mature-MMP2、mature-MMP9、N-cadherin、E-cadherin表达的影响。3.UBP43致癌作用机制的探究。第1部分:UBP43对β-catenin的调控作用及机制研究。应用Western blot检测UBP43敲低和过表达对EOC细胞中β-catenin蛋白表达水平及其下游靶基因Cyclin D1的影响。通过单染免疫荧光实验检测UBP43对β-catenin表达水平及细胞内分布的影响。通过双荧光素酶实验进一步明确UBP43敲低和过表达对β-catenin通路活性的影响。通过q RT-PCR检测EOC临床样本组织中β-catenin及下游靶基因Cyclin D1的m RNA表达水平。通过UBP43与β-catenin共染免疫荧光实验与免疫共沉淀实验明确二者之间的相互作用。用50μg/m L环己亚胺预处理细胞,于处理后0h、0.5h、1h、2h分别进行Western blot检测,观察β-catenin的降解速度,检测UBP43对β-catenin蛋白稳定性的调控作用。最后,通过免疫共沉淀实验检测UBP43对β-catenin泛素化水平的影响。第2部分:通过回复实验验证UBP43通过β-catenin信号通路发挥的促癌作用。使用β-catenin(S33Y)过表达质粒转染已成功构建的UBP43敲低(Lv-sh UBP43)稳转细胞系,通过CCK-8实验及Transwell实验检测β-catenin信号的激活对UBP43敲低介导的细胞增殖、迁移和侵袭能力抑制的逆转作用。通过Western blot实验检测β-catenin信号激活对UBP43敲低引起的Cyclin D1、mature-MMP2、mature-MMP9、N-cadherin表达水平下调和E-cadherin表达上调的影响。4.UBP43对EOC细胞增殖能力影响的体内实验。构建了裸鼠皮下异种移植瘤模型,肿瘤细胞接种后每4天测量肿瘤最长径和最短径。第28天收获肿瘤,拍照记录并测量肿瘤重量,计算体积,绘制肿瘤生长曲线,检测UBP43对异种移植瘤体内生长率的影响。Ki67及PAX8免疫组化实验检测UBP43对肿瘤细胞体内增殖活性的影响。免疫荧光实验检测肿瘤组织中UBP43和β-catenin的表达和共定位情况,β-catenin的核表达情况,探究UBP43对β-catenin的体内调节作用。Western blot检测在肿瘤组织中UBP43对β-catenin、Cyclin D1、mature-MMP2和mature-MMP9表达水平的影响。研究结果:1.TNMplot在线数据库及10对临床样本的q RT-PCR和Western blot实验检测结果显示:与正常组织相比,UBP43在EOC组织中的表达显著上调;与其他肿瘤组织相比,UBP43在卵巢肿瘤组织中尤为高表达Erdafitinib体外。生存分析结果显示UBP43的高表达与不良临床预后相关,UBP43水平较高的卵巢癌患者的生存率明显较差。2.与HOSEpi C相比,UBP43在五种EOC细胞系中的表达显著上调;成功构建了A2780和TOV-112D两细胞株的UBP43敲低和过表达稳转细胞系;UBP43敲低组的细胞增殖能力和集落形成率被显著抑制,且S期细胞百分比极显著降低,G2/M期细胞百分比极显著增加,G2/M期相关蛋白Cyclin B1和CDK1的表达减少;UBP43敲低组的细胞迁移和侵袭能力显著降低,同时UBP43敲低组细胞的mature-MMP2、mature-MMP9、N-cadherin的蛋白水平明显降低,而E-cadherin水平显著上调,抑制了EMT。与Lv-Vector组比较,UBP43过表达组实验结果则相反。3.第1部分:UBP43的过度表达引起EOC细胞中总β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1的蛋白表达水平的上调;同时,UBP43过表达引起了β-catenin细胞内分布的改变,出现异常核累积;双荧光素酶实验结果显示,UBP43的过表达显著提高了β-catenin活性;双染免疫荧光实验与免疫共沉PI3K/Akt/mTOR抑制剂淀实验结果表明:UBP43信号与β-catenin信号的亚细胞位置显著重叠,存在互相作用;此外,UBP43的过表达组β-catenin的泛素化水平被显著降低,β-catenin的蛋白稳定性显著增强,半衰期延长。而在EOC临床标本中,与癌旁组织相比,癌组织中的Cyclin D1显著高表达,但β-catenin无明显上调。第2部分:β-catenin的过表达显著逆转了UBP43敲低引起的细胞中Cyclin D1、mature-MMP2和mature-MMP9表达水平的下调以及对细胞增殖、迁移和侵袭能力产生的负向影响。同时,β-catenin的激活抑制了E-cadherin的表达,诱导了N-cadherin表达,显著地消除了UBP43敲低对EMT的抑制作用。4.与体外细胞实验结果一致:UBP43敲低组的瘤体大小、肿瘤重量及肿瘤生长率均显著降低,UBP43的敲低抑制了体内肿瘤生长,而UBP43过表达组的结果相反;UBP43敲低组肿瘤组织中的Ki67水平显著降低,UBP43的敲低抑制了肿瘤细胞增殖活性;肿瘤区域的低倍图像显示所有肿瘤组织中均存在PAX8阳性细胞,UBP43敲低组肿瘤组织中PAX8阳性细胞减少,过表达组则相反;UBP43敲低组肿瘤组织的UBP43和β-catenin蛋白质水平明显降低且β-catenin的核表达量减少,UBP43过表达组的结果则相反;免疫荧光实验观察到UBP43和β-catenin的荧光重叠,且β-catenin出现核累积,二者体内存在相互作用;一致地,UBP43敲低组肿瘤组织中β-catenin、Cyclin D1、mature-MMP2和mature-MMP9的表达水平显著低于对照组,而UBP43过表达组的结果相反。研究结论:1.UBP43在EOC中高表达且与患者预后不良有关。2.UBP43在EOC中发挥致癌作用,能够促进EOC细胞的EMT、增殖、迁移和侵袭。3.UBP43可以通过激活β-catenin信号,增加β-catenin蛋白水平并促进其进入细胞核,促进EOC进展。4.UBP43可能通过去除β-catenin上的泛素化修饰来提高β-catenin蛋白稳定性,进而促进了β-catenin信号通路的激活,促进EOC恶性进展。