癌症是公共健康的主要威胁之一,目前的治疗方法仍无法完全治愈癌症。化疗是治疗癌症的重要方法之一,然而目前临床使用的很多化疗药物存在水溶性差、非特异性组织分布、肿瘤靶向性差以及容易产生耐药性等问题。近些年各种新型药物递送系统的出现为解决这些问题提供了一个新的技术方法,通过合理设计药物递送系统,可以增加疏水性药物的水溶性,提升靶向性,具有广阔的应用前景。卡巴他赛(Cabazitaxel,CTX)是一种天然紫杉烷类化合物的半合成衍生物,其对引CX-5461说明书起紫杉醇及多西他赛耐药的P-糖蛋白具有低亲和力,CTX可以延长对多西他赛治疗无效的去势抵抗性转移性前列腺癌患者的生存期。但与其他紫杉烷类药物相同,由于其水溶性差,临床使用需加入吐温80和乙醇作为助溶剂,助溶剂的加入通常会引起强烈的不良反应;另外,CTX在体内非特异性分布,缺乏靶向性,容易导致全身毒性。不饱和脂肪酸在烷基链中至少含有一个不饱和双键,其中α-亚麻酸(α-Linolenic acid,ALA)、γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是三种重要的多不饱和脂肪酸,它们具有一定的抗肿瘤作用,且对化疗药物具有协同抗肿瘤作用。右旋糖酐(dextran,Dex)是一种大分子多糖类药物载体,具有良好的水溶性、生物相容性和稳定性,且价格较低,其结构中含有大量可以被化学修饰的羟基,可以通过酯化、醚化和氧化等反应进行衍生化。我们以右旋糖酐为载体,通过一系列化学反应将CTX及不饱和脂肪酸化学偶联到右旋糖酐上,生成的偶联物在肿瘤组织水解释放出游离的CTX发挥活性作用,偶联物可以提高CTX的水溶性和肿瘤靶向性,达到降低体内毒性和增强抗肿瘤活性的目的。我们首先对右旋糖酐进行功能化修饰,连接L-谷氨酸使其水解后带负电,连接含有叠氮基团的赖氨酸用于后续的点击化学反应。然后合成了含有炔基、赖氨酸和甘氨酸的连接臂,通过酰胺反应在连接臂上分别连接三种不饱和脂肪酸ALA、GLA和DHA,再通过酯化反应连接CTX,分别得到CTX与不饱和脂肪酸结合的化合物CTX-ALA、CTX-GLA和CTX-DHA,最后通过专一高效的点击化学反应将CTX与不饱和脂肪酸的结合物与功能化多糖进行连接,制备得到了三种不同的偶联物,分别命名为Dex-GLA-CTX、Dex-ALA-CTX和Dex-DHA-CTX;同时合成不具有不饱和脂肪酸的偶联物Dex-CTX和不具有CTX的偶联物Dex-GLA作为实验对照。通过核磁共振氢谱定量计算偶联物的载药量,偶联物Dex-GLA-CTX、Dex-ALA-CTX、Dex-DHA-CTX和Dex-CTX 的 CTX 载药量分别为 24.8%、25.4%、21.9%和 21.1%;Dex-GLA 中 GLA 的载药量为8.8%。三种偶联物Dex-GLA-CTX、Dex-ALA-CTX和Dex-DHA-CTX同时含有亲水基团和疏水基团,因此可以在水中自组装成纳米颗粒,形成的纳米颗粒均呈球形,大小均匀,无聚集,分散性较好,粒径均在61.6～90.0 nm范围之内;Zeta电位在-49.0～-32.1 mV范围内,均呈负电性,在体循环过程中稳定,粒径和电位均适用于肿瘤治疗。偶联物Dex-GLA-CTX、Dex-ALA-CTX和Dex-DHA-CTX在水中的溶解度以CTX计算分别为33.1、36.3和27.4 mg/mL,而CTX在水中的溶解度为3～7μg/mL,表明偶联物能够显著提高CTX的水溶性。在大鼠血浆中的释放实验中,原型药CTX在血浆中含量呈现时间依赖性降低,而偶联物在血浆中的CTX释放先随时间逐渐增加然后保持稳定,表明偶联物在血浆中能够缓慢释放CTX,能够维持一定的浓度,具有明显的缓释特点。在PBS的释放实验中,原型药CTX释放较快,12 h累积释放率接近100%,之后保持相对稳定;而三种偶联物中CTX的累积释放率增加缓慢并在48 h后保持相对稳定,72 h的累积释放率为38.5%～52.1%,表明三种偶联物在PBS中比较稳定。使用人前列腺癌细胞DU145和PC-3两种肿瘤细胞对偶联物的体外抗肿瘤活性进行了评价。在肿瘤细胞内药物含量实验中,偶联物在细胞中释放出游离CTX,但游离的CTX含量显著低于细胞中的总CTX含量,偶联物在细胞中释放出的游离CTX含量与原型药CTX没有显著差异,表明进入细胞中的偶联物多于原型药。在细胞增殖抑制实验中,三种偶联物及CTX对两种细胞的增殖抑制Medical Genetics均具有浓度依赖关系,并且偶联物与原型药CTX的抑制率没有明显差异,结果表明偶联物与原型药CTX具有相似的抑制细胞增殖的能力。细胞凋亡实验中,三种偶联物与原型药CTX对肿瘤细胞的凋亡诱导效果没有显著差异,表明偶联物与原型药CTX具有相似的诱导细胞凋亡的能力。使用BALB/c小鼠对偶联物Dex-GLA-CTX进行了药代动力学实验,药代动力学结果显示偶联物Dex-GLA-CTX总CTX和游离CTX的药物浓度-时间曲线下面积AUC(0-∞)和最高血药浓度Cmax均显著高于原型药CTX,偶联物Dex-GLA-CTX总CTX的AUC(0-∞)是原型药CTX的16.9倍,偶联物Dex-GLA-CTX在血浆中的总CTX和游离CTX的清除率CL(Clearence rate)显著低于原型药CTX,表明偶联物 Dex-GLA-CTX在体内循环时间更长。使用人前列腺癌细胞DU145荷瘤的BALB/c-nu裸鼠对偶联物Dex-GLA-CTX进行了组织分布实验,结果显示原型药CTX组的裸鼠肿瘤内游离CTX的含量随时间逐渐降低,而偶联物Dex-GLA-CTX组的裸鼠肿瘤内游离CTX和总CTXCaptisol MW的含量随时间先上升后降低,除1h时间点原型药CTX组肿瘤内游离CTX的含量高于偶联物Dex-GLA-CTX组,其他时间点均低于偶联物Dex-GLA-CTX组,在12、24和96 h时,偶联物Dex-GLA-CTX组在肿瘤中游离CTX的含量分别是原型药CTX的10.7、17.7和20.4倍;偶联物Dex-GLA-CTX组的裸鼠肿瘤内总CTX含量也显著高于游离CTX含量;偶联物Dex-GLA-CTX在正常组织中游离CTX的含量随时间降低,在24h后偶联物在肿瘤中的游离CTX含量高于在正常组织中的游离CTX含量,结果表明偶联物Dex-GLA-CTX能够在肿瘤部位蓄积且持续释放游离CTX,具有肿瘤靶向性、组织选择性和缓释性。使用人前列腺癌细胞DU145和PC-3的BALB/c-nu裸鼠移植瘤模型进行了体内抑瘤实验,每周一次尾静脉给药4 mg/kg和6 mg/kg两个剂量,测定瘤体积和裸鼠体重,实验结果表明三种偶联物的抑瘤活性均高于原型药,且能够显著改善CTX引起的体重下降,Dex-GLA-CTX组的裸鼠生存期最长,三种偶联物的抑瘤活性顺序为Dex-GLA-CTX>Dex-ALA-CTX>Dex-DHA-CTX,由于三种偶联物结构中除不饱和脂肪酸外均相同,证明不饱和脂肪酸对CTX的抗肿瘤协同作用大小顺序为GLA>ALA>DHA。DU145荷瘤裸鼠实验结果还证实了 Dex-GLA-CTX的抗肿瘤活性高于Dex-GLA、Dex-CTX和CTX,Dex-GLA-CTX组的体重高于CTX组,表明GLA可以提高偶联物的抗肿瘤作用,偶联物可以降低CTX的毒性作用。综上所述,合成的三种偶联物均具有载药量高、水溶性好等优点,在水中形成的纳米颗粒大小合适、结构稳定,在荷瘤裸鼠体内具有缓释性、靶向性、高疗效和低毒性,其中偶联物Dex-GLA-CTX具有最强的体内抗肿瘤活性,具有继续研究和开发价值。