研究背景特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一种常见的慢性、复发性疾病,易诊难治,临床以皮肤顽固剧烈瘙痒、干燥、湿疹样丘疱疹、结痂和苔藓化改变等为主要表现。本病好发于儿童,可严重影响患者及其家庭成员的生活质量,是全世界范围内发病率较高的皮肤病。现代医学认为,AD的发病与遗传、免疫、表皮屏障功能损伤等因素相关,并与环境关系密切;其中氧化应激是促使AD的重要因素。尽管现代医学在治疗AD方面发挥着重要的作用,但是治疗药物的副作用以及适用对象的局限性使得AD仍是皮肤科难治性疾病之一。中医认为,特应性皮炎属于“奶癣”、“四弯风”范畴。课题组在前期研究认为AD多由先天禀赋不耐,心火过盛,内扰心神Neurobiology of language,同时湿热留滞而发病。多从从心脾论治,治宜镇心安神,健脾渗湿、止痒。龙牡皮炎方是课题组根据临床经验,在镇心安神、健脾渗湿止痒为治法的基础上,加减而成的经验方,药性平和,镇心安神、祛湿健脾、标本兼顾,在缓解瘙痒、减轻皮损、减少复发率、缓解临床症状等方面取得较好疗效。本研究在前期基础上,首先建立AD小鼠模型,并对龙牡皮炎方在干预AD发展及氧化应激方面进行评价;其次通过建立腹腔注射D-半乳糖制造氧化应激后AD小鼠模型,研究AD发病皮肤氧化应激水平变化,探索龙牡皮炎方干预AD的可能机制。目的及意义实验一:龙牡皮炎方对特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究1)采用免疫损伤的方法建立AD小鼠模型,研究AD发病中小鼠氧自由基水平与抗氧化能力的变化特点;2)通过皮损程度、炎症因子水平、表皮蛋白表达水平等指标观察龙牡皮炎方对于免疫损伤AD小鼠模型的疗效及机制。实验Roxadustat分子量二:龙牡皮炎方对于氧化应激后特应性皮炎小鼠疗效及机制的研究1)采用腹腔注射D-半乳糖加免疫损伤的方法建立氧化应激诱导的AD小鼠模型,研究氧化应激后AD小鼠的氧自由基水平与抗氧化能力的变化特点;2)观察不同氧化应激程度下,AD小鼠的皮损程度、炎症因子水平等指标变化特点,以及龙牡皮炎方对于氧化应激后免疫损伤AD小鼠模型的疗效;3)通过抗氧化因子Nrf2/OH-1表达水平评价龙牡皮炎方对于氧化应激后免疫损伤AD小鼠模型的激活抗氧化通路能力。4)通过上述实验研究,根据中医“诸痛痒疮,皆属于心”的病机理论,对龙牡皮炎方进行药效评价,揭示其干预AD的可能机制,从氧化应激的角度为运用镇心安神法治疗AD提供理论基础。方法实验一:龙牡皮炎方对特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究实验分为4个组:中药组、对照组、模型组与空白组。中药组、对照组、模型组d1、d4,用2%的2,4-二硝基氯苯(DNCB)外涂BALB/c小鼠背部皮肤进行2次致敏,用量为背部200μ1/次,每次间隔3天;第2～5周,用0.2%DNCB外涂同样部位致敏,用量同上,每次间隔3天,涂抹10次。空白组仅涂抹基质。d21-d35进行灌胃,中药组用浓度分别为3.7g/ml的龙牡皮炎方灌胃,用量为0.1ml/(10g·d)。龙牡皮炎方组成为:生龙骨、煅牡蛎、炒神曲、茯苓皮、连翘、麻黄根。对照组用10mg/kg的维生素C水溶液灌胃,用量为0.1ml/(10g·d)。模型组与空白组用等量饮用水灌胃。进行上述AD诱导与药物灌胃后,通过皮损评分、皮肤组织病理评价皮损严重程度,通过免疫印迹法(western blot)检测皮损中FLG含量差异,评价各蛋白表达水平;通过免疫组织化学法检测皮损处皮肤组织的TSLP含量,作为评价瘙痒程度指标;通过ELISA方法检测血清TnF-α、IL-4、IgE水平;ABTS法测定皮肤组织氧化与抗氧化能力;实验二:龙牡皮炎方对氧化应激后特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究实验分为三步,第一步进行氧化干预,分为高氧化组、低氧化组和空白组。高、低氧化组d1-d35,每天分别用100mg/(kg·d)、500mg/(kg·d)D-半乳糖溶液进行腹腔注射,空白组注射生理盐水。第二步进行致敏。除空白组外其余小鼠d7-d14用1%DNCB外涂背部皮肤致敏2次,用量为背部200μl/次,每次间隔3天;d15～d35,用0.1%DNCB外涂同样部位致敏,用量同上,每次间隔3天,涂抹10次,空白组涂抹基质。第三部进行药物干预。在高、低氧化的基础上各自分为高剂量中药组、低剂量中药组、对照组与模型组。d21-d35进行灌胃,中药组用浓度分别为1.85g/ml、3.7g/ml的龙牡皮炎方,用量为0.1ml/(10g·d)。对照组用10mg/kg的维生素C水溶液灌胃,用量为0.1ml/(10g·d)。模型组与空白组用等量饮用水灌胃。进行上述氧化应激干预、AD样皮损诱导、药物灌胃后,对小鼠皮损外观、皮肤组织病理及皮肤中TSLP含量、血清IgE、血清细胞因子差异进行评价,评价方法同实验一。通过免疫印迹法(western blot)检测皮损中抗氧化蛋白Nrf2/OH-1表达差异。结果实验一:龙牡皮炎方对特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究1.与空白组比较,模型组小鼠血清氧自由基水平明显升高,而抗氧化能力水平明显下降(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组及中药组血清中氧自由基水平明显下降,而抗氧化能力水平明显升高,具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.从皮损程度、IgE、TNF-α、IL-4、TSLP水平评价,本方对于免疫损伤方法建立的AD小鼠模型疗效优于对照药物(P<0.05),且相对于模型组,本方对FLG表达有促进作用(P<0.05)。实验二:龙牡皮炎方对氧化应激后特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究1.特应性皮炎小鼠血清氧自由基浓度空白组显著低于氧化后的模型组(P<0.01),氧化后对照组显著低于氧化后模型组(P<0.01);低氧化的特应性皮炎小鼠的中药组氧自由基浓度显著低于对照组(P<0.05),但高氧化的特应性皮炎小鼠中药组与对照组氧自由基浓度无显著差异(P>0.05)。对比不同氧化程度的特应性皮炎小鼠血清中氧自由基水平发现,同样干预措施下高氧化组氧自由基水平比低氧化组显著升高(P<0.01),其中以模型组组间差距显著(P<0.01),对照组之间差距明显(P<0.05),而中药组之间虽有差距,但差距无统计学意义(P<0.05);特应性皮炎小鼠血清抗氧化能力检测发现,空白组显著高于氧化后的模型组(P<0.01),高氧化浓度下对照组显著低于高氧化后模型组(P<0.01),低氧化浓度的照组低于高氧化后模型组,差距无统计学意义(P>0.05);氧化后的特应性皮炎小鼠的中药组抗氧化能力显著强于对照组(P<0.05)。对比不同氧化程度的特应性皮炎小鼠血清抗氧化能力发现,同样干预措施下高氧化组整体的抗氧化能力水平比低氧化组显著降低(P<0.05),但具体至不同干预措施之间抗氧化能力则无显著差异。2.对于皮损评分,高氧化诱导的AD小鼠评分显著高于同样干预措施的低氧化组小鼠,以量化的评分评价可认为与氧化剂量存在效应关系(P<0.05)。其中以模型组差距最为显著(P<0.01),对照组与中药组虽有差距,但无统计学意义(P>0.05);对于血清IgE,高氧化诱导的AD小鼠含量显著高于同样干预措施的低氧化组小鼠(P<0.05),其中以高剂量的中药组差距最为显著(P<0.01),对照组与中药组虽有差距,但未呈现统计学意义(P>0.05);对于血清IL-4,高氧化诱导的AD小鼠含量显著高于同样干预措施的低氧化组小鼠(P<0.05),高、低氧化后的中药组差距较为显著(P<0.05),高、低氧化后的对照组血清IL-4差距显著(P<0.05),模型组虽有差距,但无统计学意义(P>0.05);高氧化诱导的模型组AD小鼠皮肤TSLP表达显著高于空白组,(P<0.05)，高氧化条件下的中药组和对照组皮肤TSLP表达于模型组无显著差距(P>0.05)3.与空白组比较,模型组小鼠皮肤Nrf2与OH-1表达明显下降(P<0.01);与模型组比较,对照组及中药组小鼠皮肤Nrf2与OH-1表达明显增加,具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。Nrf2含量在经过高氧化的AD小鼠中,模型组含量显著低于空白组(P<0.01),对照组显著高于模型组(P<0.05),中药组显著对照组(P<0.05)。OH-1蛋白检测结果与N点击此处rf2蛋白呈平行关系:模型组含量显著低于空白组(P<0.01),对照组显著高于模型组(P<0.01),中药组显著对照组(P<0.01)。4.AD小鼠皮损处TSLP含量经氧化后发现显著高于空白组,尽管未经氧化的AD小鼠皮损TSLP含量模型组同样高于空白组,但经过氧化TSLP含量模型组与空白组的灰度值差距更大,说明氧化对于TSLP的增强作用,TSLP作为AD瘙痒信号,代表AD小鼠烦躁、瘙痒程度,说明了氧化后的AD小鼠更加“心神”不安。5.在实验一中TSLP含量与皮损程度成平行关系,实验二TSLP含量组间无显著差异,TSLP作为重要AD瘙痒信号,说明在单纯的AD发病中“心神”受扰动程度与直接的症状严重程度挂钩,而在氧化之后AD病程中,“心不藏神”的情况下,尽管予中药、对照药进行干预,“心神”难安。结论实验一:龙牡皮炎方对特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究1.AD小鼠氧自由基水平上升,抗氧化能力降低,龙牡皮炎方干预AD小鼠后氧自由基水平可下降并能提升抗氧化能力,同时抗氧化能力提升程度强于降低氧自由基程度。2.AD小鼠模型中,龙牡皮炎方均可在一定程度上改善皮损组织病理,减少TSLP表达,减轻瘙痒水平,并能有效改善血清IgE及细胞因子水平,利于机体的免疫反应由Th2型向免疫平衡转变。实验二:龙牡皮炎方对氧化应激后特应性皮炎小鼠的疗效及机制的研究1.氧化应激状态对于AD小鼠的皮损程度有加重作用并上调细胞炎症因子水平。2.龙牡皮炎方对于AD小鼠ROS的有降低作用(P<0.05)),结合总抗氧化能力数据,中药可能组通过激活其他抗氧化途径,清除了 ROS以外的自由基,从而获得了较好的抗氧化能力,其作用机制可能与Nrf2/OH-1通路激活相关。3.在氧化应激的特应性皮炎小鼠模型中,龙牡皮炎方可有效降低氧化水平,并且高氧化AD小鼠中,未经中药干预的高、低氧化组之间细胞因子水平差值差异性较为显著,而中药干预后差值相对较小,因此本方可以一定程度上减轻氧化所带来的不良影响。