工业生产生物燃料所用第二代生物质原料为木质纤维素,其结晶屏障需外加能量破坏其超分子结构,预处理后的酸热环境不适宜大多数微生物生存,冰岛硫化叶菌具有嗜酸、嗜热特性受到关注。构建高效降解纤维素的嗜酸热底盘细胞对于缓解能源危机、减少能耗、保护环境具有重要意义,并为乙醇及其它化学品生产途径的搭建奠定基础。冰岛硫化叶菌应用于工业还具有纤维素酶酶活低、表达量低的限制,因此本研究以冰岛硫化叶菌(Saccharolobus islandicus)为底盘细胞,采用生物信息学和遗传学方法改造分泌系统和底物运输系统以提高其降解纤维素的能力。本研究检测到冰Emergency medical service岛硫化叶菌REY15A不能在汽爆处理的玉米芯和酸热处理的玉米秸秆中生长,能在可溶性羧甲基Empagliflozin核磁纤维素钠(CMC)中促进生长,可作为潜在的工业底盘细胞。在E233S中成功过表达内源纤维素酶SisCel1、SisCel2A以及与SisCel2A同源的SsoCel2B,酶活分析显示SisCel2A、SisCel2B的纤维素酶活较高。构建的纤维素酶敲除菌株E233/Δcel1和本实验室保存E233/AlacS在含有CMC的培养基中显示出抑制菌株生长的情况,表明SisCel1和SisLacS在底盘细胞降解纤维素中存在影响,酶活分析发现当lacS与其中一个纤维素酶基因(cell或cel2A)同时缺失时培养基浓缩上清的活性消失,SisLacS与纤维素酶之间存在调节作用。本研究以提高纤维素酶分泌量和寡糖转运量为目的对冰岛硫化叶菌进行改造,选取Ⅳ型菌毛样蛋白组装系统、信号识别系统和ABC转运系统进行探索:Ⅳ型菌毛样信号肽酶(SisFlaK)将糖结合蛋白中带正电的N端尾部移除,使得蛋白从质膜上脱落并组装成大分子结构;信号识别颗粒(SisSRP19和SisSRP54)负责将翻译中的核糖体靶向细胞膜附近,与信号识别颗粒受体蛋白(SisFtsY)结合介导蛋白质的边翻译边转运;(SisSBP)将胞外的寡糖靶向ABC转运体并介导向内转运。我们筛选上述关键分泌元件SisFlaK、SisSRP19、SisSRP54、SisFtsY和SisSBPBaf-A1生产商构建共表达菌株,酶活分析显示它们可能通过介导纤维素酶的向外转运和寡糖的向内转运,从而提高了胞内的纤维素酶数量;当信号识别系统分泌元件单独表达时未促进胞内纤维素酶酶活,表明信号识别系统各分泌元件可能需整体发挥作用。经过以上研究,我们发现:(1)REY15A可作为潜在的工业底盘细胞;(2)在E233S中成功过表达SisCel1、SisCel2A和SsoCel2B,SisCel2A、SisCel2B的纤维素酶活较高;(3)SisLacS与纤维素酶之间存在调节作用;(4)获得5个可促进纤维素降解的分泌元件(SisFlaK、SisFtsY、SisSRP19、SisSRP54和SisSBP)。本文提出一个冰岛硫化叶菌的纤维素降解和转运模型:在S.islandicus中由Ⅳ型菌毛样蛋白组装系统和Bas系统组装形成膜锚定的纤维素酶;由信号识别系统介导分泌型纤维素酶分泌到胞外。膜靶向或分泌的纤维素酶在胞外水解纤维素为低聚物,ABC转运体将低聚物转运到胞质中,随后被β-葡萄糖苷酶水解。本研究为冰岛硫化叶菌降解纤维素的合成生物学奠定了基础。