研究背景:器官功能及身体机能的维持不仅受体液因子的调节,还受神经信号的调控。由于不可逆转的神经组织损伤和难以修复,神经缺损是全球常见的临床问题,包括周围神经损伤、工程组织的神经缺失和手术并发症在内的各种因素诱发不可控的病理生理过程,导致感觉和/或运动残疾以及工程组织/器官移植失败。严重影响病人的生活质量,造成巨大的社会经济负担。但由于神经组织工程和再生医学AY-22989领域的兴起,现在,使许多用于修复和/或更换受损组织的有前途的治疗方式可供选择。神经系统通过精细的电信号网络运作,以便神经元与其他细胞类型进行通信。神经组织由传递电化学信号的电活性神经细胞组成。在脊椎动物中,周围神经系统(PNS)由许多轴突纤维组成的神经束组成,这些轴突纤维以大约100米/秒的速度向中枢神经系统(CNS)传输出入信号。因此,神经系统是包含电、离子、化学信号和特殊细胞结构的复杂组合。在过去的十年里,有机生物电子学(OBE)在与医学生物学相互作用的多个层面上有了显著的发展。该领域的核心是建立与神经系统电信号连接,以调节和控制免疫反应、器官和系统的生理状态。有机生物电子材料,即π共轭有机电半导体材料,也称为导电聚合物(CPs)。CPs具有一系列独特的特性,其电子和离子的双重传导特性与生命系统的传输模式密切相关,通过电子-离子电荷补偿建立紧密耦合,从而可以降低活细胞和生物材料之间的局部电化学阻抗。因此,CPs可以提供生物区域的理想连接,并在生物医学应用中引起了很多关注。但是,在亚细胞尺度上调节材料微观结构以在导电底物和细胞之间提供更无缝的界面仍然是一个巨大的挑战。因此,探究如何将导电聚合物组装为界面适应性结构,以及为神经界面提供电连接是解决组织工程生物区域信号连接的关键科学问题。研究目的:研究构建用于神经细胞界面连接和信号传递的分子组装结构。通过探究导电聚合物的在体组装合成,以促进神经界面的传导作用和神经的再生重建。设计固定酶触发和构建的分子组装体,探究组装体应用于组织工程血管的界面修饰,促其的神经化构建。进一步利用组织代谢机制,探究可降解的在体合成组装的导电聚合物材料。研究方法:1.在体化学组装导电聚合物促进神经组织修复本部分实验通过免疫荧光对体内组织损伤条件下的超氧化物生成及相关酶的检测,确定损伤组织区域满足苯胺氧化聚合的必要条件。通过细胞AM/PI染色检测聚合物单体和注射凝胶的细胞毒性。建立动物神经损伤模型,注射凝胶前体后不同时间点取材后,通过扫描电镜分析在体聚合后聚合物的微观形态和结构。通过原子力显微镜和显微Raman光谱确定聚合物在组织中的合成。评价在体组装导电微囊泡(CMVs)的功能和作用,通过动物行为学评估对其行为能力的影响,通过电生理检测确定CMVs在神经界面的传导作用,通过免疫荧光染色,TEM等评估在体组装对组织修复的影响和对神经再生的作用。2.CMVs的体外构建与其界面修饰促进组织工程血管神经化的研究通过脂质体挤出和包裹过氧化氢酶(CAT酶)构建亚细胞尺度的微囊泡,并通过界面聚合在体外构建CMVs。通过EDC/NHS活化脱细胞组织工程血管支架,并将导电聚合物修饰至工程血管支架外膜,构建可导电和传递离子信息的界面。通过原代神经元移植技术,构建神经化的组织工程血管支架,并通过大鼠颈总动脉移植技术,血管超声,HE染色等评价界面构建对组织工程血管的影响。3.CMVs的体内转归和组装可降解导电聚合物的探索通过HE染色,免疫荧光等组织切片和全玻片扫描激光共聚焦观察导电微囊泡在体内的动向,并探究其归属途径。拓展探究体外合成可降解的导电聚合物的合成和降解机制,并通过动物模型研究其是否可以在体内构建,以及通过SEM,CLSM等技术方法观察其形貌特征。通过电生理检测确定其功能。研究结果:1.在体组装合成的导电聚合物促进神经组织修复在体内,组织损伤后会产生大量的活性氧类物质(ROS),并且CAT酶的表达也增多,这构成了苯胺单体在体聚合的条件。体外苯胺单体可在H_2O_2和CAT酶的作用下发生聚合反应,且CAT酶可以加速聚苯胺的合成。为降低苯胺单体的生物毒性,利用氢键和静电相互作用力将ANI与海藻酸钠融合成可注射溶胶。通过大鼠坐骨神经夹伤模型,注射Alg/ANI溶胶,发现手术后1天就在组织间隙在体聚合了很多颗粒状物质。经CLSM,SEM确认,这种颗粒是大小约为2-3μm的微囊泡。经过原子力显微镜和激光显微Raman显示,这些微囊泡样物质是在体组装的导电聚合物微囊泡(CMVs)。评价在体组装CMVs的功能和对组织的影响,动物行为学显示,在体组装导电聚合物组(Alg/ANI组)大鼠对患肢的支配能力明显高于对照组,经统计坐骨神经指数(SFI)发现,ANI的在体组装可促进大鼠行动能力的恢复。通过电生理测试,发现Alg/ANI组的传导速度明显高于其他组(P<0.01),说明损伤区域的PANI CMVs可以为神经纤维提供连接和传导。通过免疫荧光染色和TEM发现,PANI CMVs的在体组装有利于神经轴突的生长和髓鞘的再生。同时,在体组装不仅可以降低局部ROS,还可以在早期募集巨噬细胞,参与PANI CMVs的组装,同时促进M1型巨噬细胞向M2型转变,实现对组织局部微环境的重塑。2.CMVs的体外构建与其界面修饰促进组织工程血管神经化的研究通过脱细胞血管基质材料,获得了小口径的组织工程血管(TEBV)。通过将PANI聚合修饰至TEBV的外表面,同时移植DRG神经元水凝胶,提高了TEBV的血管通畅性。且较短时间内,可以在TEBV外膜处发现神经纤维的长入。为了模拟在体组装的CMVs,利用脂质体挤出技术和界面合成,成功将CAT酶包裹至脂质体(Lipo@CAT)中,并在其表面组装导电聚合物。经CLSM观察,在Lipo@CAT表面聚合合成了深色的聚苯胺和聚吡咯。同时,通过EDC/NHS活化基质血管,可以将CMVs修饰到TEBV外表面,同时,通过动物血管移植和血管超声发现,修饰PPy A(聚吡咯羧酸)CMVs的实验组大鼠移植血管的通畅Immune privilege性最佳。3.CMVs的体内转归和组装可降解导电聚合物的探索研究了神经组织修复和材料整合的长期影响,经HE染色和CLSM发现在体组装的不可降解CMVs迁移到了神经外膜,并且归功于毛细淋巴管的主动运输。由此,可调降解的导电聚合物可以被应用到在体组装CMVs中。通过对吡咯、吡咯羧酸的体内外聚合和降解实验,发现PPy A在体外p H=7.4和H_2O_2的作用下可以发生解聚。并且在体内,PPy A也可以组装为CMVs并提供组织间更多的信号连接,可以提高神经传导的速度,降低神经电传导的局部电阻抗。研究结论:1.在CAT酶和组织损伤后ROS的作用下,苯胺单体可在体组装聚合。在体化学组装的导电聚合物呈微囊泡,直径约为2-3μm,为亚细胞尺度的PANI CMVs。在体组装PANI CMVs可以促进大鼠行动能力的恢复,形成组织细胞间的紧密连接,从而提高神经电信号的传导速度,并有利于神经的再生和组织局部微环境的重塑。2.PANI,PPy A CMVs修饰的TEBV界面可以通过促进TEBV的神经化从而提高血管的通畅性。3.不可降解的PANI CMVs通过毛细淋巴管被移出至神经外膜。在体聚合的PPy Aselleck NMR CMVs长期在体内可以降解。