断奶腹泻常发于仔猪、仔兔的临床养殖中,是仔猪、仔兔养殖所需面临的第一道难关。由于其具有高发病率、高致死率,并且病原学研究众说纷纭,无一定论,故而给养殖户带来了极大的经济损失。之前临床防治多以使用抗生素为主,但在当今禁抗限抗的背景下,急需新型代替药物。本研究通过中兽医辨证,将仔兔、仔猪的断奶腹泻辨证为肝郁脾虚证,并根据临床主要表现,认为经典方剂痛泻要方治疗该病最为适合。中药多糖是中药中极其重要的大分子物质,由于其广泛的生物学活性,在临床中多用于预防疾病。故而,本研究对痛泻要方多糖进行提取分离纯化,初步表征其结构,并通过慢性不可预测性应激对小鼠造成肝郁脾虚模型,通过脑-肠-菌轴探究肝郁脾虚证小鼠的发病机理以及痛泻药方多糖对其的保护作用机制,以期为临床防治断奶腹泻提供理论基础。1.痛泻要方多糖的分离纯化及结构表征本章通过水提醇沉法得到痛泻要方粗多糖,而后使用DEAE琼脂糖凝胶和琼脂糖凝胶6ff对其进行分离纯化,得到痛泻要方中性多糖(TXYF-NP)和痛泻要方酸性多糖(TXYF-AP)。其糖含量分别为7LY2157299细胞培养3.5%和83.4%,TXYF-AP的多酚含量为1.6%。通过分子排阻色谱结合多角度散射检测(SEC-MALLS)、超高效液相色谱仪(HPLC)、气质联用色谱(GC-MS)和核磁共振(NMR)对两种多糖的结构进行表征。结果表明TXYF-NP主要由果糖构成,为典型的菊糖结构,并带有一条α-1,4-Glc链,其重均分子量为3.56 k Da;TXYF-AP是一种果胶多糖,其含有半乳糖醛酸主链、鼠李糖半乳糖醛酸支链和阿拉伯聚糖的AG-I或II支链,并带有一条β-1,4-Glc链,其重均分子量为64.541 k Da。2.痛泻要方多糖对肝郁脾虚小鼠5-HT代谢及Glu-GABA受体的影响本章采取慢性不可预测性应激(CUS)对小鼠造成肝郁脾虚模型,探究痛泻药方多糖对肝郁脾虚小鼠抑郁样行为的保护作用。取96只3周龄C57BL/6雄性小鼠,适应性饲养1周后,将小鼠随机分为8组(n=12),即空白组,模型组,低、中、高剂量痛泻要方中性多糖组(50,100,200 mg/kg/day),酸性多糖组(100mg/kg/day),总多糖组(100 mg/kg/day,NP+AP,NP:AP=5:2),低聚果糖+低聚半乳糖组(FOS+GOS,100 mg/kg/day,FOS:GOS=4:3)。多糖各组每天灌胃相应多糖溶液。给药后2h,除空白组外,其余各组进行持续4周的慢性不可预测性应激以造成肝郁脾虚模型。使用实时荧光定量PCR、蛋白质印记、酶联免疫吸附试验等方法探究痛泻要方多糖对肝郁脾虚小鼠5-HT代谢及Glu-GABA受体的影响。结果表明:(1)慢性不可预测性应激导致模型组小鼠生长缓慢,出现快感缺乏、绝望的抑郁样行为;(2)模型组小鼠血清促肾上腺皮质激素(ATCH)、皮质酮(CORT)含量显著升高,下丘脑中Crhr1、Nr3c1、Nr3c2基因表达上调,海马中Crhr1、Nr3c1、Nr3c2基因表达下调,海马出现病理组织学变化,表明应激导致小鼠下丘脑-垂体-肾上BMN 673采购腺素(HPA)轴功能亢进,并损伤了海马的负反馈调节通路;(3)除Gria1外,模型组小鼠海马中Glu/GABA相关受体表达均下调,并且出现以结肠5-羟色胺(5-HT)含量升高、海马5-HT含量降低为主的色氨酸代谢紊乱,表明应激可能通过损伤海马突触传递和色氨酸代谢,导致小鼠抑郁样行为;(4)痛泻要方多糖对应激引起的损伤均有一定的保护作用,以中剂量中性多糖效果最为显著。3.痛泻要方多糖对肝郁脾虚小鼠肠道菌群及其代谢产物的影响本章通过16s r DNA测序和非靶向代谢组学检测,深入研究CUS对小鼠结肠菌群及其代谢产物的影响以及痛泻要方多糖的药理学机制。结果表明:(1)CUS造成了小鼠结肠菌群紊乱,厚壁菌门相对丰度减少,拟杆菌门相对丰度增加,其优势菌群格氏乳杆菌相对丰度显著下降,Muribaculaceae菌科相对丰度大幅升高;(2)CUS造成了小鼠结肠代谢产物紊乱,其代谢通路主要富集在蛋白质的消化吸收、氨基酸的生物合成、胆汁代谢、类固醇激素的生物合成;(3)各组多糖对肝郁脾虚小鼠结肠菌群均有一定影响,作用方式各不相同,高剂量中性多糖恢复格氏乳杆菌相对丰度的效果最优,中剂量中性多糖提升格氏乳杆菌、毛螺杆菌科、瘤胃球菌科的相对丰度,并且中性多糖均能提升拟杆菌属的相对丰度;(4)中性多糖能较好保护由CUS引起的胆汁代谢、类固醇激素的生物合成紊乱,关联分析表明可能和提升格氏乳杆菌和拟杆菌属的相对丰度有关。4.痛泻要方多糖对肝郁脾虚小鼠肠道机械屏障的影响肠道通透性增加可能导致腹泻和抑郁。本章通过实时荧光定量PCR和蛋白质印记等试验方法,检测CUS对小鼠结肠机械genetic swamping屏障的影响以及痛泻要方多糖对其的保护作用。结果表明:(1)CUS导致小鼠血清LPS含量增加,表明结肠通透性增加;(2)CUS引起小鼠结肠上皮细胞凋亡和焦亡,其作用机制可能是激活TLR4/NF-κB信号通路;(3)痛泻要方多糖均能保护由CUS诱导的结肠通透性增加,其中以中剂量中性多糖和酸性多糖效果最优。5.痛泻要方多糖对肝郁脾虚小鼠生殖功能的影响由于肝肾同源,肝的疏泄功能异常必然导致肾的闭藏出现问题。本章通过酶联免疫吸附试验、实时荧光定量PCR等方法,探究痛泻要方多糖对肝郁脾虚小鼠生殖功能的影响。结果表明:(1)CUS造成小鼠睾丸重量降低,睾丸脏器指数增加,精子浓度和存活率增加;(2)CUS导致小鼠血清卵泡刺激素、黄体生成素和睾酮浓度增加,其作用机制可能是通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)实现的;(3)痛泻要方中性多糖能够阻止由CUS诱导的小鼠机能亢进,其中以中剂量中性多糖效果最优。综上所述,CUS导致小鼠HPA轴功能亢进,色氨酸代谢紊乱,并导致结肠菌群及其代谢产物紊乱;紊乱的结肠菌群导致革兰氏阴性菌数量升高,产生过多LPS损伤结肠机械屏障;HPA轴功能亢进串扰HPG轴,导致小鼠生殖机能亢进。痛泻要方中性多糖主要为菊粉,其可通过改善肠道菌群,增加潜在益生菌的相对丰度而改善CUS导致的抑郁样行为、结肠机械屏障受损以及生殖机能亢进。痛泻要方酸性多糖主要为果胶多糖,其可通过果胶自身的抗炎抗氧化活性以及提升产丁酸菌的相对丰度,改善结肠机械屏障受损以及抑郁样行为。