绿豆是一种重要的豆科作物,因为其含有丰富的营养成分,同时具有药用价值而被广泛种植。在绿豆产品的生产过程中会产生大量的副产物–绿豆皮,绿豆皮约占绿豆总质量的7-10%,它们要么被加工成廉价饲料,要么被丢弃而得不到有效利用,造成了巨大的资源浪费。绿豆皮含有多糖、蛋白质和类黄酮等生物活性化学物质,绿豆皮多糖作为绿豆皮的主要生物活性成分之一,被证实具备良好的抑菌、免疫调节和抗氧化活性。碱溶液提取作为胞壁多糖的一种有效提取手段,能够更有效地提取不同的多糖组分,从而更容易获得存在于植物细胞不同层中的多糖组分。课题组前期研究发现碱提取绿豆皮多糖具有良好的抗氧化能力,但是其是否能缓解细胞氧化损伤以及相关分子机制尚不清楚。因此,本论文通过不同碱浓度提取绿豆皮多糖,并对其理化性质、流变性能和抗氧化性能进行了研究,以IEC-6为细胞模型,H_2O_2诱导细胞氧化损伤,对碱提取绿豆皮多糖对细胞氧Membrane-aerated biofilter化损伤的保护作用,结合RNA-seq测序探讨了碱提绿豆皮多糖缓解H_2O_2诱导的IEC-6细胞氧化损伤的分子机制,并进一步采用Western blotting和抑制剂实验对碱提取绿豆皮多糖相关调节机制进行了验证。主要研究内容和结果如下:(1)采用不同碱浓度(Na OH:H_2O,0.5%,1.0%,2.0%,w/v)从绿豆皮中制备三种绿豆皮多糖(MBP_(0.5),MBP_(1.0)和MBP_(2.0)),并考察了碱浓度对MBP提取率、微观结构、流变学性质和抗氧化活性的影响。结果表明,碱提法可以破坏多糖之间的酯键和氢键,因此碱提法提取的三种多糖的提取率均高于热水提法(MBP_W),MBP_(1.0)的提取率为3.64%。此外,与MBP_W相比,三种碱提多糖的分子量更小,粒径更小,热稳定性更好。MBP_(0.5)因半乳糖醛酸含量高、分子量低而具有更好的抗氧化活性,MBP_(1.0)和MBP_(2.0)结构紧密、表面平整,形成了较强的凝胶网络结构。(2)通过构建H_2O_2诱导IEC-6细胞为氧化应激模型,探讨了MBP对H_2O_2诱导的IEC-6细胞氧化损伤的影响。结果显示MBP在浓度范围(10-200μg/m L)内对IEC-6细胞没有毒性,可以有效地促进细胞的增殖。此外,MBP能显著缓解H_2O_2诱导的IEC-6细胞活力的下降,能够缓解H_2O_2所造成的IEC-6细胞氧化应激状态,能使SOD活性恢复到正常水平,降低细胞内脂质过氧化物MDA的含量。H_2O_2处理会使细胞内ROS水平异常提升,MBP能降低ROS水平并保护细胞免受氧化损伤。WestIACS-10759ern blotting结果也显示MBP可能通过NF-κB信号通路、MAPK信号通路和Nrf2信号通路缓解细胞氧化损伤。(3)在以上研究的基础上,采用RNA-seq测序技术分析了MBP对H_2O_2诱导的IEC-6细胞转录的影响,阐明了其作用机制。结果成功获得了细胞中的转录学信息,与空白组相比,模型组差异表达基因408个,其中上调169个,下调239个,多糖组差异表达基因2422个,其中上调946个,下调1476个。模型组和多糖组对比中,差异表达基因2670个,其中上调959个,下调1711个。KEGG富集分析表明,在显著富集的通路中,可能与MBP调节H_2O_2诱导的IEC-6细胞氧化损伤相关的信号通路包括“MAPK信号通路”及“NF-κB信号通路”。(4)在RNA-seq测序结果的基础之上,采用Western blotting和抑制剂实验对MBP缓解H_2O_2诱导的IEC-6细胞氧化损伤的MAPK和NF-κB信号通路进行了验证。通过添加MAPKselleck合成通路关键蛋白(P38、Erk1/2和JNK)特异性抑制剂。结果发现和只添加H_2O_2组比较,添加了抑制剂的H_2O_2组SOD活力有所上升,MDA水平相对下降,蛋白表达有所降低。与多糖组比较,添加抑制剂的多糖组能调节SOD活力、MDA含量和相关蛋白表达,缓解细胞氧化损伤至细胞正常水平。同样的,通过添加NF-κB通路关键蛋白抑制剂,也发现了类似结果。以上结果证明MBP能够通过MAPK信号通路和NF-κB信号通路缓解H_2O_2诱导的IEC-6细胞氧化损伤,这与RNA-seq测序结果相互印证。