研究背景:肝移植(Liver transplantation,LT)是治疗终末期肝病的有效手段之一,但免疫排斥反应仍然是限制其长期效果和生存率的主要问题之一。免疫排斥反应可以导致肝脏功能衰竭和移植物失功,严重影响受者的生存质量和生存期。近年来,随着对器官移植免疫排斥反应的不断深入研究,虽然对肝移植免疫排斥反应的机制有了更多的认识。但是,肝移植免疫排斥反应发生和发展以及新型的干预策略仍需进一步探究,以提高肝移植后的成功率和生存率。第一部分大鼠肝移植模型的建立目的:本部分研究旨在建立一种可重复且稳定的大鼠原位肝移植模型(Orthotopic liver transplantation,OLT),以便进一步研究肝移植免疫排斥反应。方法:选用同种异体大鼠,Lewis和挪威棕色大鼠(Brown Norway,BN),以“门脉优先的二袖套法”进行手术,Lewis→BN为排斥组,BN→BN为耐受组。术后观察受体大鼠的生存情况、血Bio-based chemicals清生化指标变化,并通过组织病理学分析,验证移植后模型建立是否成功。结果:对两组移植后大鼠的观察,发现移植后第3天至第5天出现食欲下降、活动减少等表现,耐受组在第7天左右开始逐渐恢复正常,而排斥组则症状加重,同时,血清谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)较耐受组明显升高,P<0.05。病理学分析显示,排斥组移植肝脏存在不同程度的排斥反应,而耐受组无排斥反应,两组排斥反应评分比较有显著性差异,P<0.05。结论:本研究采用Lewis→BN,BN→BN的组合,以“门脉优先的二袖套法”成功建立大鼠肝移植模型,达到了实验模型标准。第二部分大鼠肝移植免疫排斥反应中CD155-TIGIT基因的高度表达及关键差异基因的分析目的:肝移植术后免疫排斥反应主要是由抗原递呈过程及T淋巴细胞的激活。本部分研究通过对大鼠肝移植后肝脏组织的高通量和单细胞测序结果,分析探讨肝移植免疫排斥反应的基因变化。方法:肝移植术后免疫排斥反应发生约在术后3-5天出现,我们选择了肝移植后第7天大鼠肝脏组织进行高通量和单细胞测序检测,利用基因本体论(Gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库寻找差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)及所参与的信号通路。使用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)来鉴定免疫排斥反应的关键通路。同时,利用在线的String数据库构建差异表达基因的蛋白质互作网络(Protein-protein interaction,PPI),筛选出其中的关键基因。然后,通过单细胞测序技术对所筛选的关键基因及通路进行对比分析,定位信号通路中关键基因所在的细胞亚群。结果:1.本研究共在大鼠移植排斥反应肝组织中鉴定出5252个差异基因,其中2962个基因表达上调,2290个基因表达下调。2.GO富集分析结果显示DEGs关于生物过程(Biological process,BP)显著富集了淋巴细胞活化的调节、适应性免疫反应和白细胞细胞间粘附等通路;关于细胞成分(Cellular component,CC)显著富集了质膜外侧、膜筏和膜微区等细胞位置;关于分子功能(Molecular function,MF)显著富集在趋化因子、细胞因子和免疫受体等功能。3.KEGG分析结果提示DEGs主要富集在细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和细胞粘附分子等通路。4.GSEA分析显示细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路和细胞粘附分子是肝移植免疫排斥反应发生过程中的主要途径,通过对比分析认为T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain,TIGIT)所在的细胞粘附分子通路中关键基因差异性较大。5.根据DEGs对应蛋白之间的功能联系构建PPI网络,结合富集分析结果共筛选出了 5 个关键基因,GZMB、CXCL2、CX3CL1、CCR1 和 CCL19。6.单细胞测序结果提示,将非实质细胞分群发现单核巨噬细胞为最大群体,T细胞为第三位,随后把T细胞分为6群,其中Treg在耐受组中为最大群体。根据单细胞表达谱特征以及标记基因的表达,通过对细胞群体标记物的注释,发现白细胞分化抗原155(Cluster of differentiation 155,CD155)-TIGIT 信号通路所在的细胞群 8、19 的标记物均为CD3e,属于T淋巴细胞群体。结论:1.与免疫相关的DEGs 402个参与了免疫排斥反应,其中GZMB、CXCL2、CX3CL1、CCR1、CCL19 及 TIGIT 是关键基因。2.质膜外侧的淋巴细胞活化的调节,包括Proteases抑制剂趋化因子、细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路和细胞粘附分子等相关机制或通路,可能在肝移植术后免疫排斥反应中起重要作用。3.在肝移植术后T淋巴细胞粘附分子通路中,CD155-TIGIT信号通路可能在抑制免疫排斥反应中起重要作用。第三部分TIGIT及其信号通路在大鼠肝移植免疫排斥反应中的表达及可能的作用研究目的:通过差异基因分析,我们发现TIGIT及所在的信号通路基因差异性较明显,位于T淋巴细胞亚群。但该通路在蛋白层面的表达尚不清楚,本研究拟通过免疫方法探讨TIGIT及其通路信号蛋白在肝移植免疫排斥反应中表达强度及表达位置,为TIGIT在肝移植免疫排斥反应中的作用提供理论依据。方法:建立动物模型,选择肝移植后第7天大鼠肝脏组织,进行免疫组化及免疫荧光蛋白分子验证。结果:1.在耐受组肝血窦中可见少量炎性细胞浸润,散在少数TIGIT阳性细胞,油镜(100×)下观察从形态学上为TIGIT+的淋巴细胞。与耐受组相比,排斥组肝血窦周围可见大量浸润大量炎症细胞,炎性细胞中见多数TIGIT+细胞浸润,油镜下观察阳性细胞中多数TIGIT+淋巴细胞。2.CD155-TIGIT信号通路中CD155在TIGIT+T细胞表面高表达。趋化因子配体CXCR3和共刺激因子配体GITRL均有阳性细胞表达,从形态学中认为CD155、CXCR3位于淋巴细胞上,GITRL位于巨噬细胞上。3.免疫荧光显示,CD155-TIGIT信号通路主要于CD4+T细胞上,提示通过T细胞影响肝移植免疫排斥反应。结论:在大鼠肝移植中,TIGIT可能通过调控其信号通路CD155-TIGIT的方式,抑制肝移植术后免疫排斥反应。第四部分TIGIT及其通路能够抑制T细胞的激活和功能表达目的:前两部分研究我们TIGIT在T淋巴细胞上,可能通过其信号通路CD15Z-VAD-FMK供应商5-TIGIT抑制T细胞的功能,进而抑制肝移植免疫排斥反应。本研究拟通过体外细胞实验深入探究TIGIT及其通路对T细胞的影响,为TIGIT在肝移植中作用和机制提供理论依据。方法:在肝移植免疫排斥反应中,T细胞激活后分泌的炎症因子中,起促炎作用的是:IL-6、IL-23、TNF-α、INF-γ;抗炎作用的是:IL-10、TNF-β。我们为了验证 CD155-TIGIT信号通路的改变对T细胞功能的影响,通过体外细胞共培养实验,采用来源于Lewis大鼠的腹腔巨噬细胞,BN大鼠的脾脏CD4+T细胞共培养以模拟体外肝移植免疫排斥环境,通过构建TIGIT沉默的细胞系及CD155刺激激活TIGIT通路的方式,验证TIGIT及CD226的蛋白表达及T细胞活化后炎症因子的表达。分组如下:T+M group:CD4+T细胞+巨噬细胞T+M shTIGIT group:沉默TIGIT表达后的CD4+T细胞+巨噬细胞T group:CD4+T 细胞T+CD155 group:CD155+CD4+T 细胞T+M+CD155 group:CD155+CD4+T 细胞+巨噬细胞结果:1.共培养 24h 后 T+M shTIGIT group 的炎症因子 IL-6、IL-23、TNF-α、INF-γ水平明显高于T+M group(P<0.05),抗炎因子IL-10、TNF-β水平略升高于T+M group,(P<0.05);2.将Tgroup 与 T+CD155 group 对比,加入 CD155 之后 T+CD155 group 中 IL-10 明显上调,INF-γ则明显下降,P<0.05;3.将T+CD155 group 与 T+M+CD155 group 对比,T+M+CD155 group 中 IL-10 明显上调,INF-γ下调,P<0.05;4.将T+M group 与 T+M+CD155 group 对比,在接受 CD155 刺激后,T+M+CD155 group较T+M group中抗炎因子IL-10明显上调,P<0.05,炎症因子INF-γ明显受到抑制,P<0.05。结论:CD155-TIGIT通路在细胞实验中能够抑制T细胞的激活,表现为抗炎因子(如IL-10)的分泌增加,促炎因子(如INF-γ)的分泌减少,提示CD155-TIGIT抑制肝移植排斥反应可能通过抑制T细胞的激活来实现。全文结论:1.本研究采用“门脉优先的二袖套法”的方式成功建立Lewis→BN和BN→BN的方法大鼠原位肝移植模型。2.高通量及单细胞测序显示在肝移植术后免疫排斥反应中T淋巴细胞是关键的细胞亚群,其中细胞粘附分子通路中CD155-TIGIT信号通路可能在肝移植术后的免疫排斥反应中起重要作用。3.在大鼠肝移植免疫排斥反应中,TIGIT可能通过调控其信号通路CD155-TIGIT的方式,抑制T细胞的激活,进而抑制肝移植术后免疫排斥反应。