Gefitinib molecular weightγ-氨基丁酸(GABA)是一类非蛋白质氨基酸,作为主要的抑制性神经递质在中枢神经系统中广泛分布,并具有丰富的生理功能,如可以参与摄食、代谢、内分泌、免疫等多种生理活动的调节作用。作为一种功能性饲料添加剂,目前的研究主要集中在畜禽动物,有关水产动物尤其是虾蟹类甲壳动物则鲜有报道。对底栖生活习性的蟹类而言,水体底层是其一生大部分时间的生活活动区域。底层复杂的生态和生物环境使得动物体更容易遭受病原菌和低氧的威胁。因此,采用营养调整策略提高蟹类的免疫力和低氧耐受能力显得尤为重要。本研究以中华绒螯蟹(幼蟹)为研究对象,综合应用多种研究方法和技术手JNJ-42756493溶解度段,首先从调节摄食、消化、免疫和抗菌等方面,探究了GABA对幼蟹生长和免疫的影响,然后评估了GABA对幼蟹低氧耐受能力的调节作用,并在此基础上分别探究了低氧诱导的神经兴奋性毒性效应和毒性机制,以及GABA在低氧响应中的可能神经保护作用分子机制。主要结果及结论如下:1.幼蟹饲料GABA的适宜添加量及对生长和免疫的调节作用本研究旨在探究GABA在中华绒螯蟹幼蟹摄食、消化、生长性能和免疫反应的调节作用。试验配制了6组不同GABA添加水平的饲料,每组分别为0 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg、320 mg/kg和640 mg/kg,并在喂养幼蟹8周后进行24 h的脂多糖(LPS)攻毒试验。结果显示:饲料适量添加GABA可显著提高幼蟹的蜕壳频率(MF)、增重率(WG)、摄食率(FI)以及消化和吸收相关酶的活性。此外,在脑神经节、胸神经节和肠道组织中,促食性神经信号相关基因的表达显著上调,厌食性神经信号相关基因表达则显著下调。同时,在脑神经节和胸神经节中,参与味觉调节和奖赏调节的主要基因表达水平显著上调,而与惩罚调节有关的基因的表达水平则显著下调。结果表明GABA可能作为一种促食性神经信号,或与其它食欲相关神经信号协同作用,通过参与调节饱腹感回路和奖赏回路来促进摄食。基于SGR和WG对添加GABA水平的双斜率折线回归分析表明,饲料中适宜的GABA添加水平为84-89 mg/kg,该添加量可以有效地改善幼蟹的生长性能、摄食量和消化吸收能力。研究还显示饲料添加适量GABA可以显著增加幼蟹血清中血蓝蛋白含量、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性,并显著降低了谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性。同时,饲料添加适量GABA可以显著增加幼蟹血清中超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽含量,并显著上调肝胰腺中抗氧化相关基因和免疫相关基因的转录水平。相比于PBS处理,LPS攻毒组中抗脂多糖因子、有关炎症信号通路和促凋亡的m RNA水平显著升高,而抗凋亡相关的m RNA水平则明显下调。然而,饲料添加适量GABA有效地减轻了LPS诱导的免疫过度反应和细胞凋亡。上述结果表明GABA可以作为一种免疫调节剂,提高幼蟹的非特异性免疫和抗氧化能力,并有效缓解免疫介导的免疫过度反应。综上所述,在饲料中添加适量的GABA对幼蟹的生长性能和免疫调节有明显的促进作用。2.急性低氧应激下GABA对幼蟹的代谢调节和神经保护作用鉴于GABA在生长和免疫调节中的积极作用,本研究进一步探究了急性低氧应激下GABA对幼蟹呼吸和能量代谢的影响,初步评估了急性低氧造成的神经损伤和GABA对神经的保护作用。养殖试验为期8周,随后进行24 h的急性低氧应激处理(DO:1.0±0.1 mg/L)。结果显示急性低氧应激显著上调了低氧诱导因子1α(HIF 1α)的表达水平,耗氧率和无氧呼吸代谢相关酶活性显著升高,有氧呼吸代谢相关酶活性显著降低。饲料中添加GABA显著改变了急性低氧应激下幼蟹的呼吸代谢模式,有氧呼吸相关酶活性显著升高,无氧呼吸相关酶活性显著下降,并且HIF 1α的表达水平和耗氧率均显著下降。此外,急性低氧应激显著升高了血糖和乳酸(LD,血清和肝胰腺中)的含量及甲壳动物高血糖激素基因(CHH)的表达水平,肝糖原和中华绒螯蟹胰岛素样肽基因(Es＿ILP)及肌肉磷酸精氨酸(PA)水平均显著下降,而饲料添加GABA显著逆转了这种变化趋势。急性低氧应激还显著增加了神经组织中游离谷氨酸(Glu)和GABA的含量,N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)相关受体基因和凋亡相关基因的表达水平均显著上调,而饲料添加GABA可以有效地预防急性低氧诱导的神经损伤。此外,饲料添加GABA可以显著改善急性低氧应激下幼蟹体内的氧化还原状态。以上结果表明,急性低氧会导致中华绒螯蟹幼蟹的有氧代谢抑制和氧化应激,并且会诱导神经组织损伤,而添加GABA可以通过调节代谢模式、提高抗氧化能力和发挥神经保护作用,从而提高幼蟹对低氧环境的耐受能力。3.急性低氧诱导幼蟹的神经兴奋性毒性及其可能机制前期研究发现急性低氧可以诱导神经组织凋亡基因的显著上调,表明急性低氧可能会对神经系统造成毒性损伤。为了进一步明确急性低氧对幼蟹神经系统造成的毒性效应,本研究探讨了急性低氧应激(DO:1.0±0.1mg/L)24 h对中华绒螯蟹幼蟹神经兴奋性毒性的诱导作用及可能的毒性机制。结果显示,与对照组相比,低氧组血糖和血清LD含量显著升高,CHH和HIF-1α的表达水平显著上调。RNA-Seq结果显示急性低氧应激对碳水化合物代谢的影响比脂质和蛋白质代谢的影响更为显著。同时,急性低氧导致神经细胞的凋亡率显著增加,凋亡相关基因的表达也呈现了类似的趋势。RNA-Seq结果提示急性低氧应激可能通过调节多种凋亡相关途径诱导神经元凋亡。此外,低氧组胸神经节神经组织中游离Glu和GABA含量显著高于对照组,并且NMDA相关受体的基因表达水平显著上调。钙依赖性降解酶和内源性抗氧化相关蛋白或酶的基因表达也呈现了类似的趋势。与此同时,与对照组相比,低氧组中高亲和力神经元谷氨酸转运体(n Glt)基因的表达水平显著上调,囊泡谷氨酸转运体(v Glt)基因的表达显著下调。注射NMDA-R拮抗剂(MK-801和Ro25-6981)的结果证实,NMDA-R是Glu诱导神经神经毒性的桥梁和核心。综上,急性低氧应激造成的能量代谢抑制和氧化还原失衡影响了谷氨酸转运体对Glu的重摄取过程,进而导致NMDA型通道过度开放并激活系列降解酶,最终诱发了幼蟹的神经兴奋性毒性和神经元毒性损伤。4.综合生理和多组学分析探究GABA在幼蟹低氧响应中的神经保护作用以上研究显示急性低氧可以诱导神经兴奋性毒性损伤,而GABA呈现出了明显的保护效应。为了揭示急性低氧应激下GABA对中华绒螯蟹的神经保护途径和可能代谢调控机制,开展了为期8周的养殖试验,随后进行24 h的急genetic manipulation性低氧应激处理(DO:1.0±0.1 mg/L),并对幼蟹胸神经节进行了凋亡分析和转录组学与代谢组学的联合分析。结果表明,与低氧组相比,GABA预处理显著降低了幼蟹脑神经节和胸神经节细胞的凋亡率。组学分析结果显示,差异基因和差异代谢物共同注释到了11条KEGG通路,其中共同富集的KEGG通路中仅有鞘脂信号通路和花生四烯酸代谢通路显著性富集。在鞘脂信号通路中,GABA处理显著增加了胸神经节中长链神经酰胺的含量,其通过激活下游信号来抑制低氧诱导的细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。在花生四烯酸代谢途径中,GABA可以通过调节花生四烯酸的物质代谢以增加神经保护活性物质的含量,减少有害代谢物的含量,从而参与炎症调节和神经保护。本研究初步揭示了GABA对低氧应激下幼蟹的神经保护途径和可能机制,并为水产动物低氧耐受研究新靶点的发掘提供了借鉴。