目的:肺癌是一种发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌病理类型的绝大多数,靶向治疗是肺癌治疗的一种重要方式。Skp2过表达存在于多种肿瘤类型之中,Skp2蛋白能介导其经典底物p27蛋白的泛素化降解过程,使细胞从G1期进入S期,推动细胞周期进程,促进癌细胞增殖,Skp2已经作为新型癌症治疗药物开发的一个作用靶点。肺癌在中医中可归属于“痰饮”范畴,痰既是肺癌的病因,也是其病理产物。中药化橘红(Citrus grandis‘Tomentosa’,CGT)味辛苦,性温,归肺经,具有理气化痰之功,临床已用于治疗多种呼吸道疾病,但其提取物直接抗肺癌药效、作用机制和其有效活性成分未见文献报道。因此,本课题对化橘红抗NSCLC活性及调控Skp2/p27信号轴抑制NSCLC增殖的作用机制进行研究,并初步探究其抗NSCLC作用的有效活性成分,以期探索化橘红抗NSCLC药物开发前景,为研发高效低毒的NSCLC治疗策略提供理论依据,也为中医药以“化痰”法治疗肺癌的理论提供基础研究支撑。方法:1、通过回流和超声提取分别制备化橘红水提取物(CGTA)和化橘红乙醇提取物(CGTE)。通过溶剂萃取法对CGTE进行萃取,分别制备化橘红石油醚萃取物(CGTPE)、化橘红乙酸乙酯萃取物(CGTEA)和化橘红正丁醇萃取物(CGTNB)。采用MTT法比较两种提取物和三种萃取物对NSCLC细胞生存活力的影响,筛选化橘红各种提取物和萃取物抗NSCLC活性。2、通过MTT、平板克隆和细胞周期实验检测CGTE和CGTPE对NSCLC细胞增殖的影响。3、通过蛋白质免疫印迹实验检测CGTE对Cyclin D1、p27和p21蛋白的影响。4、通过蛋白质免疫印迹、CHX和MG-132实验检测CGTE和CGTPE对Skp2/p27信号轴的影响。5、通过细胞热位移测定(CETSA)、免疫共沉淀(co-IP)和体内泛素化实验检测CGTE和CGTPE对Skp2-SCF E3泛素连接酶活性的影响。6、构建Skp2过表达稳定细胞系,验证CGTE和CGTPE通过Skp2/p27信号轴发挥抗NSCLC效果的作用机制。7、构建C57BL/6小鼠LLC皮下同种移植瘤模型和BALB/c裸鼠A549皮下异种移植瘤模型,利用苏木素和伊红(H&E)染色、免疫组化(IHC)和蛋白质免疫印迹实验评价CGTE和CGTPE体内抑制NSCLC生长的效果并验证其作用机制。8、采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对CGTE进行化学成分定性分析。并通过MTT和蛋白质免疫印迹实验对CGTE有效成分抗NSCLC活性进行初步探索。结果:首先,我们对化橘红提取物抗NSCLC效果和作用机制进行了研究。通过对制备的CGTA和CGTE进行抗NSCLC活性筛选,发现CGTE较CGTA具有更强的体外抗NSCLC活性,所以本课题选用CGTE对化橘红抗NSCLC药效、作用机制及有效成分进行研究。MTT实验结果表明CGTE以剂量依赖性的方式抑制多种NSCLC细胞的增殖。我们选用相对较低浓度的CGTE(100、200和300μg/m L),继续检测CGTE对NSCLC细胞增殖的影响。通过平板克隆实验发现,CGTE可显著抑制NSCLC细胞的低密度增殖能力,细胞周期实验也进一步证明了CGTE显著诱导NSCLC细胞G0/G1期周期阻滞,表明CGTE可通过诱导G0/G1期阻滞抑制NSCLC细胞增殖。接着,我们通过蛋白质免疫印迹实验检测CGTE对Cyclin D1、p27和p21蛋白表达的影响,结果表明CGTE对G1期特异性周期蛋白Cyclin D1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21蛋白水平无影响,而能够显著升高p27蛋白表达水平。p27能够严格调控细胞从G1期到S期的转换进程,p27蛋白降解的主要机制是Skp2依赖的泛素蛋白水解途径。鉴于Skp2与其经典底物p27蛋白表达和细胞周期G1期阻滞密切相关,我们通过蛋质免疫印迹实验检测CGTE对这两种蛋白表达的影响,结果发现,CGTE在NSCLC细胞中可以显著升高p27蛋白表达,同时下调Skp2蛋白表达。CHX实验进一步证明,CGTE在NSCLC细胞中增加了p27蛋白的半衰期,同时缩短了Skp2蛋白的半衰期,破坏了Skp2蛋白的稳定性。提示CGTE可能通过抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶活性促进p27蛋白累积,诱导NSCLC细胞G0/G1期阻滞,从而达到抑制NSCLC细胞增殖的效果。我们接着验证CGTE是否通过Skp2/p27信号轴抑制NSCLC细胞增殖。CETSA结果显示,CGTE提高了Skp2蛋白的热稳定性,表明CGTE有效活性成分具有结合Skp2蛋白的潜能。co-IP实验结果显示,CGTE抑制了Skp2与骨架蛋白Skp1的结合作用,从而破坏Skp2-SCF复合物的完整性;CHX实验表明CGTE显著缩减Skp2蛋白半衰期,而蛋白酶体抑制剂MG-132此网站可以抑制CGTE对Skp2蛋白的促降解效应,证明CGTE通过干扰Skp2-SCF复合物完整性促进Skp2蛋白降解。体内泛素化实验结果表明,CGTE抑制了p27蛋白体内泛素化水平。以上实验结果验证了CGTE能抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶活性,使得p27泛素化水平降低,促进了p27蛋白累积。在NSCLC细胞中通过慢病毒感染过表达Skp2可以显著减弱CGTE对Skp2/p27信号轴以及NSCLC细胞增殖的抑制作用,进一步验证了CGTE通过Skp2/p27信号轴抑制NSCLC细胞增殖。此外,我们通过构建C57BL/6小鼠LLC皮下同种移植瘤模型和BALB/c裸鼠A549皮下异种移植瘤模型,证实了CGTE(1 g/kg和2 g/kg)给药具有体内抗NSCLC生长的效果。CGTE能够下调肺癌组织中Skp2蛋白表达,同时升高p27蛋白表达,并能下调肺癌组织中细胞增殖相关核抗原Ki67的表达水平,从而验证了CGTE在体内通过Skp2/p27信号轴抑制肺癌增殖的作用机制。CGTE各剂量均未对C57BL/6小鼠和BALB/c裸鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)和尿酸(UA)的含量造成显著影响,也未造成明显的组织病理损伤,但CGTE高剂量(2g/kg)给药会导致C57BL/6小鼠体重出现较明显下降。UPLC-MS/MS分析鉴定出CGTE中390种化合物,主要包括黄酮类、香豆素类、脂质、酚酸类、生物碱和萜类等化合物,CGTE化合物中匹配度和相对含量较高的化合物为柚皮苷、柚皮素、野漆树苷、芹菜素、新北美草苷、橙皮内酯、佛手酚、蛇床子素、葡萄内酯、黄柏酮和柠檬苦素等,鉴定结果为化橘红抗NSCLC有效成分研究奠定了基础。在确定Cnucleus mechanobiologyGTE抗NSCLC药效和作用机制的基础上,我们对CGTE中发挥抗NSCLC活性的有效成分进行了初步探索。根据UPLC-MS/MS鉴定结果和文献报道,我们挑选了柚皮苷、野漆树苷、芹菜素、柚皮素和柠檬苦素5种有效成分。通过细胞活性实验比较这5种有效成分抗NSCLC效果,实验结果显示,相比其他4种化合物,柠檬苦素可以较显著降低NSCLC细胞活性。通过蛋白质免疫印迹实验发现柠檬苦素(50、100和150μM)在NSCLC细胞中可以显著升高p27表达,并下调Skp2蛋白表达,提示柠檬苦素可能通过抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶活性促进p27蛋白的累积。表明柠檬苦素是CGTE抗NSCLC活性较高的一种有效成分。鉴于CGTE给药剂量较高,且较高剂量给药时会影响小鼠体重,提示CGTE直接用于药物开发具有局限性。因此,本课题基于CGTE的研究结果,对化橘红中抗NSCLC效果更好的有效部位进行了探索。通过对制备的CGTPE、CGTEA和CGTNB进行抗NSCLC活性筛选,发现CGTPE较其余两种萃取物具有更好的肺癌细胞杀伤效果,且与CGTE相比用药剂量更低,所以我们选用CGTPE(50、75和100μg/m L)继续探究化橘红的抗NSCLC药效和作用机制。通过体外细胞实验发现,CGCompound 3化学结构TPE与CGTE同样能通过作用Skp2/p27信号轴诱导NSCLC细胞G0/G1期阻滞,并抑制NSCLC细胞增殖。体内A549皮下荷瘤实验结果也表明CGTPE在较低剂量下(200 mg/kg、400mg/kg和800 mg/kg)给药具有显著体内抗NSCLC生长的效果。CGTPE体内同样能够下调肺癌组织中Skp2蛋白表达,同时升高p27蛋白表达,并能下调肺癌组织中Ki67的表达水平,CGTPE各剂量组给药后裸鼠体重都没有出现明显下降,且未表现出明显的器官毒性,相较CGTE所用剂量也更低。结论:CGTE和CGTPE能够抑制NSCLC细胞在体内外增殖,其作用机制与其调控Skp2/p27信号轴相关,证实了化橘红具有抗NSCLC效果。