研究背景严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)属于β冠状病毒属,其感染导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)对全人类健康造成严重威胁。使用一代新冠疫苗进行大规模基础免疫和加强免疫,可以遏制这种病毒的大流行,而新出现的变异株(VOCs)可以逃避疫苗接种和单克隆抗体的中和保护,增加再感染的风险,急需研发针对VOCs的下一代疫苗和更高效、稳定的单克隆抗体。研究目的评估自然感染原型株COVID-19恢复期患者的免疫原性特征,为疫苗的研发提供新的思路和见解;并结合Illumina Miseq高通量测序和生物信息学技术筛选SARS-CoV-2单克隆抗体。研究方法1.样本收集:从广东省21家医院收集384份COVID-19病例的血液样本用于抗体水平的测定和相关性研究;从广东省第二人民医院和佛山市第四人民医院收集12份COVID-19恢复期病例的血液样本用于单克隆抗体的建库及筛选。2.评估COVID-19恢复期患者的免疫原性特征:通过ELISA实验测定SARS-CoV-2与其他6种冠状病毒间的交叉反应水平,通过中和实验和Spearman秩相关分析中和抗体与IgA、IgM、IgG抗体之间的相关性,同时评估VOCs的中和抗体下降情况;此外,通过单因素分析和多元线性回归模型分析中和抗体下降的影响因素。3.单克隆抗体库的构建及筛选:通过对COVID-19selleck抑制剂恢复期患者进行外周血单个核细胞(PBMC)的分离,提取总RNA,通过arm-PCR技术的iR试剂盒进行免疫组库建库,使用Illumina MiSeq平台测序,结合生物信息学方法进行蛋白对接、结构模拟和功能预测筛选以RBD为靶标的单克隆抗体,并对其进行表达与纯化Entinostat溶解度,最后通过生物膜干涉技术(BLI)和中和实验对单克隆抗体进行效果评估,此外对免疫组库BCR-IGH的数据进行分析。研究结果1.SARS-CoV-2 与 SARS-CoV 存在强交叉反应(S-IgM 51.32%,S-IgG 78.25%,N-IgM 89.52%,N-IgG 100.00%),但与 MERS-CoV交叉反应却不明显(S-IgM novel medications25.59%,S-IgG 14.89%,N-IgM 28.23%,N-IgG 26.18%),与 4种季节性冠状病毒存在不同的交叉反应;2.中和抗体与IgG存在强相关性(r=0.667,p<0.001),IgG或许可以用作中和抗体产生的替代标记;3.COVID-19恢复期患者血清对VOCs的中和能力显著降低,年龄、发热和激素治疗是中和抗体下降的独立危险因素;4.利用COVID-19恢复期患者PBMC成功构建了 SARS-CoV-2的抗体组库,筛选并成功表达23个单克隆抗体;5.病情严重程度较轻的个体,其免疫组库多样性可能更好。研究结论1.感染SARS-CoV-2原型株诱发的体液免疫抗体对VOCs的中和作用较弱,这阻碍了针对原型株的一代疫苗的保护效果。2.本研究结合Illumina MiSeq高通量测序和生物信息学方法,从COVID-19恢复期患者PBMC中快速筛选并成功表达了 23个单克隆抗体,证明了该种方法的可行性,为SARS-CoV-2的研究提供了有力工具。