据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2021年度全球最新癌症统计数据显示,2021年全球新发癌症病例1810万例,癌症死亡病例955万例,其中肺癌死亡病例占比18%,依旧是全球死亡率最高的癌症。此外,非小细胞肺癌(NSCLC)患者约占比肺癌总人数的85%,约70%患者一经发现已是中晚期,5年生存率仅14%。近年来,分子靶向药物的发展改变了对NSCLC的治疗方式和患者的预后治疗。NSCLC靶向治疗是指使用抑制剂对特定靶点进行药物干预,其中最具有代表性的就是表皮生长因子受体(EGFR)。EGFR突变常见于NSCLC中,其可激活下游信号通路,导致细胞的异常增殖与活化。表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKIs)则通过抑制异常活化的EGFR,从而达到治疗效果。然而,约20%的患者在使用初代EGFR-TKIs后会产生Met原癌基因扩增。Met原癌基因扩增会导致EGFR旁路的肝细胞生长因子受体(c-Met)异常高表达,从而绕过上游EGFR直接激活其下游信号通路,产生获得性EGFR-TKIs耐药。因此,开发一款能同时针Compound 3临床试验对EGFR和c-Met的双重抑制剂对于解决EGFR-TKIs获得性耐药的问题,极具意义。本课题前期借助计算机辅助药物设计(CADD)软件,分析了多个已被公开报道的EGFR和c-Met抑制剂的结构模型,最终将EGFR上市药物Afatinib和c-Met抑制剂Foretinb定为先导化合物。基于Afatinib和Foretinib的结构特征,运用活性药效团的揉合拼接、骨架跃迁、生物电子等排和引入卤素等策略,设计了3个系列(TS-1～TS-30、TS-31～TS-36和TS-37～TS-48)、共计48个新型4-苯氧基喹唑啉类化合物。目标化合物均通过~1H NMR、~(13)C NMR和TOF MS图谱确证与HPLC的纯度确证。首先,我们对48个目标化合物的进行了体外生物活性评估和构效关系研究。采用MTT法分别对3个系列的化合物进行了细胞毒性实验和ADP-Glo~(TM)法进行体外激酶活性测试,结果显示:(1)R_1为无取代苯环时有利于提高EGFR激酶的活性;(2)五原子部分引入供电子基团(脲和杂环结构)有利于提高c-Met激酶的活性;(3)R_2为短链取代时细胞毒活性和激酶抑制活性要明显优于长链取代;当取代基团为迈克尔受体(丙烯酰胺)时,综合活性最佳;(4)在五原子部分引入四原子侧链时,c-Met活性显著降低,这与c-Met抑制剂的“五原子规则”相符。其中化合物TS-41被鉴定为最优选化合物,对多株NSCLC细胞的毒性与阳性对照药Afatinib相当;对c-Met激酶抑制活性是阳性对照组Foretinib的21倍。其次,我们探究了最优选化合物TS-41的体外抗肿瘤作用机制:(1)分子模拟对接结果显示,化合物TS-41较好地嵌入EGFR蛋白与c-Met蛋白空腔内,与EGFR空腔内的Cys-797和Met-793氨基酸残基形成关键氢键;与c-Met蛋白空腔中的Met-1160和Asp-1222氨基酸残基形成关键氢键;(2)JC-1染色实验结果直观地表明,化合物TS-41可以诱导A549和H1975细胞的凋亡并呈现浓度依赖性;(3)通过流式细胞术测定Anne Xin V-FITC/PI双染细胞凋亡实验表明,化合物TS-41可诱导A549细胞的晚期凋亡;(4)通过流式细胞术测定PI单染细胞周期实验表明,化合物TS-41可将A549细胞阻滞在G0/G1期并具有浓度依赖性;(5)细胞划痕实验结果表明,化合物TS-41可在体外阻止A549细胞的迁移。为了进一步探究最优选化合物TS-41的体内抗肿瘤活性,我们首先对化合物TS-41进行了毒性评估:(1)溶血实验中,最优化合物TS-41在128μg/m L的浓度下达到5%的溶血率,优于上市药物Afatinib(64μg/m L的浓度下达到5%的溶血率);(2)小鼠毒性实验结果显示,在100 mg/kg的高浓度给药浓度下,经血液生化仪分析和脏器染色切片观察,血液各项指标正常,脏器无明显病变。最后,我们建立了A549异种移植瘤模型来探究化合物TS-41的体内抗肿瘤活性,结果显示:高Belnacasan采购剂量给药组(60 mg/kg)的抑瘤率达到了55.3%,而阳性给药组(60 mg/kg)的抑瘤率则为46.4%immediate postoperative;此外,给药期间各组裸鼠体重并未明显下降,这说明化合物TS-41在体内无明显毒性。综上,本课题基于先导化合物Afatinib与Foretinib的结构特征,设计、合成了48个未见文献报道的4-苯氧基喹唑啉类化合物,其中对最优选化合物TS-41做了一系列体内外生化实验并探究了其抗肿瘤作用机制。结果表明,化合物TS-41是一款用于治疗EGFR-TKIs获得性耐药问题的高效、低毒性的EGFR/c-Met双重抑制剂,值得被进一步探索研究。