β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素具有分解作用,所以其会被非法添加至乳制品中用以降解抗生素。近些年,乳制品中非法添加β-内酰胺酶的事件层出不穷,所以开发一种能够检测β-内酰胺酶的试剂盒是非常有意义的。TEM-1型是国内数量最多、最常见的β-内酰胺酶。纳米抗体是一种稳定性高、特异性强、易表达生产的抗体,在食品与生物医学等多领域应用广泛。本研究利用噬菌体展示技术,成功构建了针对TEM-1的纳米抗体展示文库,筛选得到针对TEM-1的纳米抗体序列进行克隆表达,开发了针对TEM-1的噬菌体介导的双抗夹心ELISA试剂盒。主要实验结果如下:1.抗TEM-1纳米抗体展示文库的构建及淘选。根据大肠杆菌表达系统的密码子使用偏好性,优化了TEM-1基因序列,将优化后的序列构建至质粒p ET-25b(+)中进行表达,使用重组蛋白TEM-1免疫羊驼四次后,构建了库容量为1.20×10~8cfu的原始文库,经菌落PCR鉴定后,VHH基因的插入率为100%。经过M13KO7辅助噬菌体救援之后,成功地获得了滴度为6.80×10~(13)cfu/m L的噬菌体展示纳米抗体文库。采用固相亲和生物筛选法进行筛选,最终获得了10个独特序列的纳米抗体。2.抗TEM-1纳米抗体的原核表达及纯化。将筛选得到的10个具有独特序列的纳米抗体的基因序列克隆至p ET-25b(+)载体中,将其转化至Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE进行鉴定。其中,Nb9展示出良好的结合活性,同时Nb9的特异性良好,将其用于后续实验。3.TEM-1检测试剂盒的初寻找更多步研制。以Nb9作为捕获抗体,经过抗体对的STM2457供应商排除与配对筛选,最终确定以phage8为检测抗体,建立了噬菌体介导的双纳米抗体夹心ELISA检测TEM-1方法。其线性范围为7.8～250 ng/m skin microbiomeL,最低检测限为5.1 ng/m L。应用于牛奶检测中,回收率区间为83.1%～93.4%。