【目的】中风,又称脑卒中,是全球第二大死亡原因,也是我国成人致死、致残的主要原因。中风的发病率在近年更是迅速攀Hydration biomarkers升,给全球的社会医疗保障与个人家庭带来巨大的负担。脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion,CI/R)是脑卒中后神经损伤的主要原因也是影响疾病预后的原因之一。然而,CI/R损伤现有的治疗方法并无法满足日益增长的来自临床与患者的诊疗需求,其相关药物仍待更进一步的研究与开发。近年来,多肽分子因其低毒性、高选择性、高活性等特点引起广泛关注,逐渐成为药物开发的热点和新的着力点。在天然肽类来源中,两栖类动物尤其是蛙科作为生物活性肽的资源库,越来越受到人们的关注。然而,关于两栖动物来源的神经保护肽的报道仍然极为稀缺。本研究旨在探索新的能够缓解CI/R损伤的两栖动物源性神经保护肽,并从细胞-组织-分子角度探索其神经保护机制;同时利用肽类分子作为分子探针的优势,以外源性多肽分子探索可能的药物靶标与内源性疾病发病机制。为相关中枢神经系统疾病,特别是CI/R的治疗提供更多可能性。【方法】通过构建大绿臭蛙的c DNA文库获取大绿臭蛙来源多肽分子OL-FS13,其在4℃、25℃、37℃、60℃条件下以及血浆中的稳定性利用反相高效液相色谱法探索。OL-FS13在体外的神经保护活性通过肾嗜铬细胞瘤细胞(Adrenal pheochromocytoma cells,PC12细胞)的氧糖剥夺/复氧模型(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)以及细胞增殖检测(MTS法),已细胞存活率判定细胞损伤程度。OL-FS13的体内神经保护活性通过大鼠大脑中动脉栓塞模型,评价损伤的方法分别为改良的神经功能缺损评分(Modified nerve severZD1839研究购买ity scale,m NSS)、氯化三苯基四氮唑染色、苏木精-伊红染色以及尼式染色。体内外氧化应激损伤程度通过超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的检测进行评估。通过蛋白质免疫印迹法对相关信号通路中蛋白的表达进行检测。m RNA和微小RNA多组学测序用以从非编码RNA角度评估OL-FS13抗卒中的机制。mi R-21-3p与CAMKK2靶向关系利用双荧光素酶法检测。通过实时-荧光定量PCR法检测mi R-21-3p与CAMKK2 m RNA表达水平。【结果】OL-FS13来自大绿臭蛙(Odorrana livida,O.livida)的皮肤,一级结构为FSLLLTWWRRRVC,分子量为1736.09 Da;OL-FS13在血浆中半衰期为19.9 min,在4℃和25℃条件下能够长期保存;OL-FS13能够缓解OGD/R对细胞的损伤(最佳浓度100 p M);OL-FS13减轻CI/R对大鼠的脑损伤(最佳剂量10μg/kg),表现为m NSS评分的改善、脑梗死面积减少以及组织损伤减轻;OL-FS13能够提高体内、外SOD、CAT水平并降低MDA和LDH水平;OL-FS13通过激活Nrf-2/HO-1轴减轻氧化应激,通过抑制IRE1α/JNK轴减轻内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激;OL-FS13通过激活Nrf-2途径加强抗氧化应激系统,发挥抗氧化应激功能,进而减轻ER应激损伤;OL-FS13神经保护作用中mi R-21-3p/CAMKK2轴起关键作用;OL-FS13通过激活CAMKK2/AMPK轴缓解能量应激;OL-FS13通过抑制mi R-21-3p激活CAMKK2AZD6738体内/AMPK信号通路进而实现神经保护作用。【结论】本研究报道了一种新的神经保护肽(OL-FS13),它来源于大绿臭蛙的皮肤。OL-FS13能够拮抗OGD/R对于PC12细胞的损伤,并且对CI/R引起的神经损伤有显著的缓解作用。这些神经保护作用可能是通过激活Nrf-2/HO-1和抑制IRE1α/JNK信号通路进而实现对氧化应激和ER应激损伤的抑制作用。在OL-FS13抗卒中的过程中,Nrf-2在其抑制氧化应激和ER应激损伤引发的细胞凋亡中起着关键作用。进一步的研究发现,OL-FS13通过抑制mi R-21-3p激活CAMKK2/AMPK/Nrf-2轴,减轻OGD/R和CI/R引起的损伤。本研究突出了OL-FS13在抗卒中领域潜在的应用价值,在为两栖动物来源神经保护肽研究增加研究对象的同时,还为肽类药物作为分子探针的研究与应用提供了新的可能性。