第一部分 HER2-TKI对胃癌细胞HER2蛋白表达的影响目的:探讨HER2酪氨酸激酶抑制剂(HER2-TKI)对HER2阳性胃癌细胞HER2蛋白表达的影响。方法:本研究使用了两株表达HER2的胃癌细胞株SNU216和NCI-N87。采用:1.Western blot验证所用两株细胞HER2蛋白的表达水平;2www.selleck.cn/products/AZD1152-HQPA.Western blot检测不可逆TKI吡咯替尼和波齐替尼、可逆TKI拉帕替尼和图卡替尼分别处理后各细胞HER2蛋白表达的变化。结果:1.Western blot验证结果:SNU216和NCI-N87细胞均显示Hospital infectionH ER2蛋白过表达,NCI-87表达水平明显高于SNU216(P<0.001);2.We stern blot实验结果显示:不同浓度的吡咯替尼和波齐替尼干预24h,各细胞中HER2蛋白表达水平随药物浓度增大而降低(P<0.01);不同浓度的拉帕替尼和图卡替尼干预24h,各细胞中HER2蛋白表达水平随药物浓度增大而升高(P<0.05);同浓度的吡咯替尼和波齐替尼在不同时间进行干预,各细胞中HER2蛋白表达水平随时间延长而降低(P<0.05);同浓度的拉帕替尼和图卡替尼在不同时间进行干预,各细胞中HER2蛋白表达水平随时间延长而升高(P<0.001)。第二部分 HER2-TKI调控HER2蛋白表达的机制探讨目的:探讨HER2-TKI引起HER2蛋白降解的机制。方法:1.RT-qPCR检测经拉帕替尼(可逆HER2-TKI)和吡咯替尼(不可逆HER2-TKI)分别在不同时间点处理各细胞后HER2 mRNA的表达水平;2.Western blot检测吡咯替尼分别联合蛋白酶体抑制剂Velcade、M G-132和溶酶体抑制剂Baf-A1处理各细胞后HER2蛋白表达水平;3.免疫共沉淀检测吡咯替尼联合MG-132处理各细胞后HER2泛素化水平、HSP 90蛋白表达水平。结果:1.RT-qPCR结果显示:SNU216和NCI-N87细胞分别经拉帕替尼和吡咯替尼处理后HER2 mRNA表达水平随时间延长而增多(P<0.05);2.Western blot结果显示:与单药吡咯替尼相比,吡咯替尼联合蛋白酶抑制剂Velcade、MG-132可明显抑制HER2蛋白的降解(P<0.05),而联合溶酶体抑制剂Baf-A1对HER2蛋白表达无明显影响;3.免疫共沉淀结果显示:与单药吡咯替尼组比,吡咯替尼联合蛋白酶体抑制剂MG-132后HER2泛素化随时间延长而增多、与HER2结合的HSP90蛋白随时间延长而减少。第三部分 HER2-TKI对T-Dxd抗HER2阳性胃癌作用的影响目的:探讨HER2-TKI体外促进T-Dxd抗HER2阳性胃癌细胞的作用及体内抗肿瘤疗效。方法:1.激光共聚焦显微镜观察经吡咯替尼处理后HER2在细胞内的定位变化;2.荧光标记T-Dxd,激光共聚焦显微镜观察吡咯替尼处理后,T-Dxd内吞的变化;3.CCK-8检测吡咯替尼、T-Dxd联合吡咯替尼对HE R2阳性胃癌细胞的增殖活性;4.建立胃癌移植裸鼠模型,分为四组:对照组、吡咯替尼组、T-Dxd组和联合组(吡咯替尼联合T-Dxd),观察各组肿瘤的生长变化及裸鼠体重变化。待实验结束后处死裸鼠,剥取瘤组织,取部分组织做免疫组织化学和Western blot观察各组HER2蛋白的表达情况。结果:1.免疫荧光结果显示:在未经处理的SNU216和NCI-N87细胞中,HER2染色表明受体主要定位于细胞膜上。而在吡咯替尼处理后,H ER2聚集成颗粒状或簇状分布在细胞膜下或胞浆内;2.激光共聚焦显微镜观察结果显示:与单药T-Dxd相比,T-Dxd联合吡咯替尼细胞内荧光强度随时间延长而增强;3.CCK-8结果显示:各单药对各细胞的生长抑制率随药物浓度增加而增加,呈剂量依赖性。吡咯替尼联合T-Dxd可提高低剂量T-Dxd的抑制率;4.体内实验:吡咯替尼组及T-Dxd组的裸鼠移植瘤体积及肿瘤重量均小于对照组,尚未达到统计学意义。联合组的裸鼠移植瘤体积及肿瘤重量明显小于对照组(P<0.001)。裸鼠移植瘤组织免疫组化结果显示:吡咯替尼组、T-Dxd组和联合组中HER2染色程度均低于对照组,联合组染色程度最浅;裸鼠移植瘤组织Western blot结果显示吡咯替尼组、T-Dxd组和联合组中HER2蛋白表达水平均低于对照组,联合组明显降低(P<0.001)。结论:1.可逆HER2-TKI可引起HER2阳性胃癌细胞HER2蛋白表达水平升高,不可逆HER2-TKI可引起HER2阳性胃癌细胞HER2蛋白表达水平降低。2.不可逆HER2-TKI通过诱导HSP90与HER2解离,增强了 HER2泛素化和随后在蛋白酶体的降解。3.不可逆HER2-TKI在体外可增JNJ-42756493配制强HER2内化及T-Dxd的内吞,促进了 T-Dxd对胃癌细胞增殖的抑制效应。4.不可逆HER2-TKI在体内可有效提高T-Dxd对HER2阳性胃癌的抗肿瘤活性。