研究目的本研究通过在体对肥胖小鼠施加运动、70%饮食控制、饮食控制联合运动和离体对骨髓间充值干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)施加机械牵拉、鸢尾素(Irisin)和整合素αVβ5(Integrin-alpha V-beta 5,IntegrinαVβ5)沉默/过表达等干预,探究Irisin/IntegrinαVβ5信号通路在调控BMSCs成骨/脂分化中的作用,为揭示肥胖性骨质疏松症的分子机制提供实验依据,也为寻找有效的防治方法提供可靠的理论依据。研究方法和材料第一部分饮食控制/有氧运动对肥胖小鼠骨质量及Irisin/IntegrinαVβ5信号通路的影响1.实验动物与分组:60只刚断乳的雄性C57BL/6小鼠,随机分为标准饲料组(Normal diet group,ND组,喂养标准饲料,10只)和高脂饲料组(High fat diet group,HFD组,喂养高脂饲料,50只)。喂养高脂饲料10周后,将肥胖造模成功小鼠随机分成四组:肥胖对照组(Obesity control group,OC,n=10)、肥胖饮食控制组(Obesity calorie restriction group,OR,n=10)、肥胖有氧运动组(Obesity exercise group,OE,n=12)、肥胖饮食控制联合有氧运动组(Obesity calorie restriction combined with exercise group,ORE,n=12)。同时将标准饲料组小鼠设为正常对照组(Normal control group,NC,n=10)。OR和ORE组小鼠自第11周开始逐渐减少进食量,第13周后开始控制进食量为OC组的70%,直到第18周干预结束。OE和ORE组小鼠从第11周开始通过递增运动时间和运动速度的方式增加跑台运动负荷,第12周后运动负荷固定在20m/min,60min/d,坡度0度,直到第18周干预结束。2.检测方法:采用Micro-CT扫描方法获得小鼠股骨骨体积(Bone volume,BV)、组织体积(Tissue volume,TV)、骨小梁体积分数(Percent bone volume,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb.Th)、骨小梁分离度(Trabecular separation,Tb.Sp)、连接密度(Connection density,Conn.Dn)和结构模型指数(Structure model index,SMI)参数,并进行3D松质骨结构重建;通过三点弯曲实验法检测股骨最大载荷、破坏载荷、弯曲强度和弹性模量材料力学性能指标;采用酶联免疫法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)方法检测小鼠血清中鸢尾素(Irisin)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)和抗石酒酸酸性磷酸酶-5b(Tartrate resistant acid phosphatase-5b,TRACP-5b)浓度;采用H&E染色法观察小鼠股骨骨髓脂肪细胞形态,并统计骨髓脂肪细胞数量和体积;采用PCR和Western-blot方法检测分别检测小鼠胫骨Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(Fibronectin type Ⅲ domain cotaining protein 5,FNDC5)、Irisin、IntegrinαVβ5、转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGFβ1)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 map kinase,p38MAPK)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、PR结构域蛋白16(PR domain containing 16,PRDM16)、诱导细胞死亡DFFA样效应子α(Cell death inducing DFFA like effectorα,CIDEα)和解偶联蛋白1(Uncoupling protein 1,UCP1)的mRNA、蛋白水平。第二部分Irisin和牵张应力调控BMSCs成骨/脂分化的作用及机制1.BMSCs中IntegrinαVβ5的检测:使用完全培养基、成骨和成脂培养基分别培养C57BL/6小鼠BMSCs7天后,再采用Western-blot和PCR技术检测BMSCs是否存在IntegrinαVβ5的表达。2.筛选Irisin剂量:分别使用不同浓度Irisin(0、50、100和500ng/ml)干预BMSCs细胞,通过CCK-8实验检测细胞增殖,并通过PCR技术检测成骨(TGFβ1/p38MAPK/Runx2)和棕色脂肪因子(PRDM16/CIDEα/UCP1),以筛选Irisin最佳剂量,并采用该剂量对BMSCs进行干预。3.筛选机械牵张强度:在FX-5000 Tension System设置0%、2%、4%和8%强度机械牵张刺激,对BMSCs进行每天1次的机械牵张刺激(Stretch)。实验结束后,通过CCK-8实验检测细胞增殖,使用PCR技术检测上述成骨/棕色脂肪因子mRNA,以筛选牵张应力最佳强度,并采用该强度对BMSCs进行干预。4.Irisin和stretch干预BMSCs分化:对BMSCs分别进行Irisin、stretch和Irisin+stretch刺激,干预结束后成骨分化组进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红染色,并采用PCR技术检测上述成骨因子mRNA水平。成脂分化组进行油红O染色,并采用PCR技术检测上述棕色脂肪以及白色脂肪因子ASC型氨基酸转运体1(Asc-type amino acid transporter 1,ASC-1)、同源框C8(Homeobox C8,HOXC8)和同源框C9(Homeobox C9,HOXC9)mRNA水平。5.Integrinβ5基因干扰:对BMSCs Integrinβ5基因过表达/沉默后,分别设置pEx-BLANK、pEx-Integrinβ5、pEx-Integrinβ5+Irisin、pEx-Integrinβ5+stretch和pEx-Integrinβ5+Irisin+stretch组,以及scr-siRNA、si-Integrinβ5、si-Integrinβ5+Irisin、si-Integrinβ5+stretch和si-Integrinβ5+Irisin+stretch组。干预结束后,分别通过PCR和Western-blot方法检测相关成骨/棕色脂肪因子mRNA和蛋白水平。研究结果第一部分:饮食控制/有氧运动对肥胖小鼠骨质量及Irisin/IntegrinαVβ5信号通路的影响1.肥胖组:(1)与NC组相比,OC组小鼠BV/TV、Tb.N和Conn.Dn(P<0.05)明显降低,Tb.Sp明显增加(P<0.05)。3D重建图片显示,OC组小鼠骨微结构受到严重的破坏。(2)与NC组相比,OC组小鼠血清Irisin、OCN和BALP浓度均明显降低(P<0.05),血清TRACP-5b浓度则明显升高(P<0.05)。(3)与NC组相比,OC组小鼠最大载荷、破坏载荷和弯曲强度明显降低(P<0.05)。(4)与NC组相比,OC组小鼠骨髓脂肪细胞数量和体积明显增加(P<0.05)。(5)与NC组相比,OC组小鼠骨组织FNDC5 mRNA和Irisin蛋白明显下降(P<0.05),同时成骨(TGFβ1/p38MAPK/Runx2)和棕色脂肪因子(PRDM16/CIDEα/UCP1)也明显降低,IntegrinαV和Integrinβ5的mRNA和蛋白水平无显著性差异(P>0.05)。2.饮食控制/有氧运动干预组:(1)与OC组相比,OR组BV/TV、Tb.N和Conn.Dn明显增加(P<0.05),OE和ORE组BV、BV/TV、Tb.N和Conn.Dn明显增加(P<0.05),OR组的Tb.Sp明显降低(P<0.05),OE和ORE组的Tb.Sp和SMI明显降低(P<0.05);与OR相比,ORE组小鼠BV/TV、Tb.N和Conn.Dn升高更明显(P<0.05)。3D重建图片显示,OR、OE和ORE组小鼠骨微结构破坏明显缓解(P<0.05)。(2)与OC组相比,OR组最大载荷和弯曲强度明显升高(P<0.05),OE和ORE组最大载荷、破坏载荷、弯曲强度和弹性模量明显升高(P<0.05)。(3)与OC组相比,OR、OE和ORE组血清中Irisin和OCN浓度均明显升高(P<0.05),ORE组血清中BALP水平也明显升高(P<0.05),OE和ORE组血清中TRACP-5b浓度均明显降低(P<0.05);与OR和OE组相比,ORE组小鼠血清Irisin、BALP和OCN浓度明显更高(P<0.05);且与OR组相比,ORE组小鼠血清TRACP-5b水平明显降低(P<0.05)。(4)与OC组相比,OR、OE和ORE组小鼠骨髓脂肪细胞AV和AN参数明显降低(P<0.05);与OR和OE组相比,ORE组小鼠骨髓脂肪细胞AV和AN参数明显更低(P<0.05)。(5)与OC组相比,OR、OE和ORE组小鼠骨组织中FNDC5 mRNA和Irisin蛋白明显升高(P<0.05),上述成骨/棕色脂肪因子水平也明显升高,但IntegrinαV和Integrinβ5 mRNA和蛋白水平无显著性差异(P>0.05);与OR和OE组相比,ORE组FNDC5/Irisin、这些成骨/棕色脂肪因子水平更高(P<0.05)。第二部分:Irisin和牵张应力调控BMSCs成骨/脂分化的作用及机制1.BMSCs细胞存在IntegrinαVβ5的表达,Irisin最佳剂量为100ng/ml,牵张应力最佳强度为4%stretch。2.成骨分化条件下:(1)与control组相比,Irisin、stretch和Irisin+stretch组ALP酶活性、钙结节数量和OD_(570)值明显升高(P<0.05)。与Irisin和stretch组相比,Irisin+stretch组ALP酶活性、钙结节数量和OD_(570)值更高(P<0.05)。(2)与control组相比,Irisin、stretch和Irisin+stretch FNDC5、TGFβ1、p38MAPK和RUNX2的mRNA水平明显升高(P<0.05),但各干预组IntegrinαV和Integrinβ5的mRNA无显著变化(P>0.05);与Irisin和stretch组相比,Irisin+stretch组TGFβ1、p38MAPK和RUNX2的mRNA水平更高(P<0.05)。3.成脂分化条件下:(1)与control组相比,Irisin、stretch和Irisin+stretch组脂滴形成明显减少,OD_(520)值明显降低(P<0.05);与Irisin和stretch组相比,Irisin+stretch组脂滴形成最少(P<0.05),OD_(520)值最低(P<0.05)。(2)与control组相比,Irisin、stretch和Irisin+stretch组FNDC5、PRDM16、CIDEα和UCP1的mRNA水平明显升高(P<0.05),白色脂肪因子ASC-1、HOXC8和HOXC9的mRNA水平明显下降(P<0.05),但各干预组IntegrinαV和Integrinβ5的mRNA无显著变化(P>0.05);与Irisin和stretch组相比,Irisin+stretch组棕色脂肪因子mRNA水平明显更高,白色脂肪因子mRNA水平明显更低(P<0.05)。4.BMSCs过表达Integrinβ5基因,同时进行Irisin和stretch干预。结果显示与pEx-BLANK组相比,pEx-Integrinβ5组IntegrinαV、Integrinβ5、TGFβ1、p38MAPK、Runx2、PRDM16、CIDEα和UCP1的因子水平明显升高(P<0.05);与pEx-Integrinβ5组相比,pEx-Integrinβ5+Irisin、pEx-Integrinβ5+stretch和pEx-Integrinβ5+Irisin+stretch组的TGFβ1、p38MAPK、Runx2、PRDM16、CIDEα和UCP1的因子水平明显更高(P<0.05),stretch和Irisin+stretch组FNDC5 mRNA和Irisin蛋白水平也明显升高(P<0.05),IntegrinαV和Integrinβ5的mRNA、蛋白水平无显著性差异(P>0.05);与pEx-Integrinβ5+Irisin和pEx-Integrinβ5+stretch组相比,pEx-Integrinβ5+Irisin+stretch组这些成骨/棕色脂肪因子的水平更高(P<0.05)。5.沉默Integrinβ5基因,同时进行Irisin和stretch干预。结果显示,与scr-siRAG-221 IC50NA组相比,si-Integrinβ5组IntegrinαV、Integrinβ5、TGFβ1、p38MAPK、Runx2、PRDM16、CIDEα和UCP1的因子水平明显降低(P<0.05);与si-Integrinβ5组相比,si-Integrinβ5+Irisin、si-Integrinβ5+stretch和si-Integrinβ5+Irisin+stretch组IntegrinαV、Integrinβ5、TGFβ1、p38MAPK、Runx2、PRDM16、CIDEα和UCP1的因子表达无显著性差异(P>0.05),但stretch和Irisin+stretch组的FNDC5mRNA和Irisin蛋白水平明显升高embryonic stem cell conditioned medium(P<0.05)。结论1.肥胖引起Irisin/IntegrinαVβ5信号通路损伤,BMSCs成骨/脂分化失衡,骨微结构破坏,力学性能下降,可能是诱发肥胖性骨质疏松的原因之一。2.饮食控制、有氧运动和联合干预可能通过改善骨中Irisin/IntegrinαVβ5AZD2281信号通路信号损伤,缓解BMSCs成骨/脂分化失衡,改善骨髓脂肪异常增多和骨微结构破坏,提高骨形成和骨强度,逆转肥胖性骨质疏松,且联合干预效果好于单一干预。3.牵张应力可以通过Irisin/IntegrinαVβ5上调成骨因子TGFβ1/p38MAPK/Runx2表达和棕色脂肪因子PRDM16/Cideα/UCP1的表达,调控BMSCs分化。