背景与目的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的结核病(Tu购买Canagliflozinberculosis,TB)是广泛流行的慢性传染病。MPT64是Mtb的分泌抗原之一,也是Mtb毒力因子。MPT64可调控宿主的免疫应答,且可诱导抗Mtb感染的保护作用。因此,MPT64是TB诊断和疫苗研究候选抗原之一。本研究旨在制备抗MPT64单克隆抗体(mAb)并建immunoelectron microscopy立双抗体夹心ELISA检测体系;基于上述mAb,探究MPT64对宿主固有免疫的调控作用及其在宿主抗Mtb感染中的作用。本研究为MPT64用于TB快速诊断提供了工具,明确了MPT64在宿主抗Mtb感染中的作用机制。方法与结果1.结核分枝杆菌MPT64单克隆抗体的制备原核表达MPT64重组蛋白并亲和层析纯化,蛋白经皮下免疫小鼠,取脾细胞与杂Q-VD-Oph供应商交瘤细胞融合,经初筛、单克隆化获得14株mAb。ELISA和Western blot鉴定表明各株mAb均能特异性识别重组MPT64蛋白,亚型均为Ig G,效价为1:80～1:2560。叠加ELISA筛选获得C8H9、F5E2、H2F4分别与A5B2株mAb为配对抗体。成功制备了H2F4与A5B2株mAb腹水,亲和层析纯化mAb。间接ELISA检测纯化的H2F4、A5B2株mAb效价分别为1:102 400、1:51 200;SDS-PAGE和Western blot检测显示,2株mAb纯度高,且均能特异性识别Mtb菌体中天然MPT64,不与卡介苗(BCG)、耻垢分枝杆菌(Ms)和金黄色葡萄球菌(SA)非特异性结合。2.MPT64双抗体夹心ELISA的建立制备生物素(Biotin)标记的A5B2 mAb检测抗体,以H2F4 mAb为捕获抗体建立MPT64双抗体夹心ELISA,棋盘滴定法优化捕获抗体和检测抗体的浓度分别为1.25μg/m L、2.5μg/m L。以常规条件作为初始反应条件,依次优化各个环节的反应条件,获得该体系的最适条件为:CBS(p H 9.6)包被H2F4 mAb(1.25μg/m L)100μL,4℃静置过夜,洗涤;2%BSA于室温进行封闭1 h,洗涤;待测样品室温孵育2 h,洗涤;100μL Biotin-A5B2 mAb(2.5μg/m L)室温孵育2 h,洗涤;Avidin-HRP(0.5μg/m L)室温孵育1 h,洗涤;TMB显色,2 M H_2SO_4终止,酶标仪检测OD_(450)。分析所建立ELISA体系的关键参数,结果显示其对MPT64的检测下限为39ng/m L,线性范围为39～1 250 ng/m L(R~2=0.982 3),变异系数小于9.5%,回收率为89.177～104.390%。与MPT64反应的特异性良好,不与BCG、无关细菌及成分发生交叉反应。进一步检测Mtb H37Ra菌株不同生长阶段的培养上清,发现MPT64含量与Mtb活菌数成正比,最早在培养第12 d被检测为阳性,MPT64为4.09 ng/m L。3.MPT64对宿主固有免疫的调控及其在抗Mtb感染中的作用小鼠分别经尾静脉和腹腔注射高、低剂量的MPT64 mAb,再以Mtb H37Ra滴鼻感染,检测脏器荷菌数和小鼠体内的MPT64抗体含量。结果显示,静脉注射和腹腔高剂量注射的mAb至少可存在2 w,腹腔低剂量注射的mAb已被清除;脏器荷菌数结果显示,各处理组间荷菌数无统计学差异,低剂量静脉注射mAb组小鼠肺荷菌数小幅度增加,高剂量静脉注射mAb组肺荷菌数减少。抗MPT64 mAb预处理骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),再以Mtb H37Ra感染,发现mAb提前6 h预处理并不影响Mtb胞内存活,mAb提前0 h预处理促进了Mtb的胞内存活。MPT64蛋白体外刺激BMDM和MH-S巨噬细胞,实时定量PCR检测结果显示促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS和炎症小体关键蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1转录水平上调。此外,BMDM细胞感染模型结果显示,MPT64诱导的炎症反应显著抑制Mtb感染早期(1～3 d)的胞内存活能力,该效应在NLRP3~(-/-)BMDM中消失,表明MPT64促进宿主对Mtb感染的清除与NLRP3激活有关。结论本研制备了14株抗MPT64 mAb,并获得配对抗体,建立了MPT64双抗体夹心ELISA检测体系,运用该检测体系定量分析Mtb培养液中MPT64辅助分析Mtb含量。初步证实MPT64可诱导NLRP3炎症小体活化,促进巨噬细胞对Mtb感染的清除效应,但该效应在小鼠体内并不明显。