沙门菌(Salmonella)是一种重要的人畜共患革兰氏阴性病原菌,不仅引起人的腹泻和食物中毒,还会导致动物的败血症及流产。鸡群感染鸡白痢沙门菌(Salmonella Pullorum)后会导致腹泻、死亡率升高和产蛋率下降等危害,造成严重的经济损失。由于禽沙门菌血清型众多且耐药性逐渐增强,持续监测禽沙门菌的流行分布及耐药情况对该疾病的防控具有重要意义。鸡白痢既可以水平传播又可以垂直传播,建立一种特异性强、灵敏度高的鸡白LEE011浓度痢抗体检测方法用于种鸡场的鸡白痢沙门菌净化十分必要。本研究通过蛋白免疫印迹和间接酶联免疫吸附实验ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法筛选出鸡白痢特异性蛋白Adhe和Bfr,并以此为基础研制单抗建立竞争抑制ELISA检测方法,为种鸡场鸡白痢的净化提供了诊断和检测工具。1 2021-2022年度长三角部分地区禽源沙门菌的分离鉴定2021年7月至2022年7月,对苏皖部分地区、扬州大学动物医院的病料,以及长三角部分地区的野禽样品进行沙门菌的分离鉴定,利用麦康凯平板培养基、沙门菌显色培养基和SS培养基对沙门菌进行培养和纯化。对疑似菌落Gefitinib说明书利用多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction,mPCR)和玻板凝集试验确定其血清型;然后通过药敏纸片法测定其对21种抗生素的耐药性。结果显示,从采集的650份家禽源病料样品中分离培养出69株沙门菌(10.62%),其中鸡白痢沙门菌占比52.17%(36/69),鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)占比 34.87%(24/69)和肠炎沙门菌(Salmonella Enteritis)占比13.04%(9/69)。药敏试验结果显示,69株分离菌株对氨基糖苷类、磺胺类及酰氨醇类药物敏感,对β-内酰胺类及大环内酯类药物耐药,其中有51株沙门菌对青霉素耐药,耐药率为73.91%(51/69),有66株沙门菌对红霉素耐药,耐药率为95.65%(66/69),值得注意的是,所有分离菌株对苯唑西林和利福平的耐药率达到100%(69/69)。69株沙门菌中有57株为多重耐药菌株,多重耐药率达到82.61%。野禽源样品共检测了 1472份,最终获得14株沙门菌(0.95%),其中鸡白痢沙门菌占比50%(7/14),鼠伤寒沙门菌占比28.57%(4/14),肠炎沙门菌占比14.28%(2/14)和阿贡娜沙门菌(Salmonella Aguna)占比7.14%(1/14),药敏结果显示野禽源分离株对利福平和苯唑西林的耐药率可达到92.86%(13/14),而对环丙沙星、阿米卡星敏感,耐药率均低于20%以下,多重耐药率为14.28%(2/14)。以上研究结果表明,2021-20systems biochemistry22年长三角部分地区的禽沙门菌优势血清型为鸡白痢沙门菌,家禽源中多数菌株对三类及三类以上抗生素耐药,因此应持续对禽沙门菌的流行及耐药情况予以监测。2鸡白痢沙门菌特异性蛋白的表达及筛选参阅文献筛选鸡白痢沙门菌优势抗原抑炎效应蛋白Ipaj、细菌铁蛋白Bfr、热休克蛋白60 Groel和乙醇脱氢酶Adhe。将Bfr、Groel、Adhe和Ipaj基因克隆至原核表达载体pET28及pET32,经诱导表达后收集并纯化蛋白,以鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌及肠炎沙门菌等沙门菌属内和大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)及肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)等沙门菌属外的感染血清为一抗,利用蛋白免疫印迹和间接ELISA的方法进行鸡白痢特异性蛋白的筛选,结果表明Adhe和Bfr蛋白是鸡白痢特异性蛋白,对鸡白痢阳性血清有较强且良好的特异反应,为后续制备单克隆抗体建立单抗竞争抑制ELISA检测方法奠定了基础。3基于鸡白痢沙门菌Adhe和Bfr单抗竞争ELISA方法的建立纯化鸡白痢沙门菌特异性蛋白Adhe和Bfr,免疫6～8周龄BALB/c小鼠,利用单克隆抗体技术分别成功获得稳定分泌特异性针对Adhe及Bfr蛋白的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为6G11和5B8;亚型鉴定结果显示两株单抗均为IgG 2a亚类;WB结果显示,6G11和5B8均能特异性识别鸡白痢沙门菌,特异性良好。分别以纯化的GST-Adhe和GST-Bfr蛋白为包被抗原,用方阵实验摸索出抗原的最佳包被浓度分别为0.9375 μg/mL和0.3125 μg/mL;单抗腹水稀释度分别为1:160和1:140;血清稀释度均为1:2;蛋白包被条件为4℃、12 h;封闭条件为37℃、1.5 h;一抗作用条件均为37℃、1.5 h;酶标二抗作用条件均为37℃、1 h;TMB显色时间均为10 min。针对Adhe蛋白的单抗,竞争ELISA的阳性临界值为29.34%,阴性临界值为22.6%;针对Bfr蛋白的单抗,竞争ELISA阳性临界值为20.99%,阴性临界值为16.55%;介于两者之间的需要重新检测。特异性结果显示建立的方法具有良好的特异性。敏感性结果显示建立的竞争ELISA方法均高于玻板凝集试验,同时针对Adhe单抗的竞争ELISA的敏感性高于针对Bfr单抗的。阳性血清样品检测结果显示,31份经玻板凝集检测为阳性的血清均能被针对Adhe和Bfr单抗竞争ELISA检测方法检测出来。临床血清样品检测结果显示,针对Adhe和Bfr单抗竞争ELISA检测方法和玻板凝集试验阳性率分别为72%、60%和84%,针对Adhe和Bfr单抗竞争ELISA检测方法与玻板凝集试验的符合率分别为85.71%和71.42%。因此,针对Adhe单抗竞争ELISA检测方法更适合用于临床血清样品检测,符合率更高,为鸡白痢的净化提供诊断和检测工具,具有较好的应用价值。