J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)是反转录病毒科(Retroviridae),甲型反转录病毒属(Alpharetrovirus)的成员,是引起鸡骨髓细胞瘤、血管瘤等肿瘤性免疫抑制病的病原。J亚群禽白血病在世界范围内呈地方性流行态势,给全球的养禽业带来了巨大的经济损失。近年来ALV-J一直处于快速变异和进化中,病毒的gp85基因以及基因组末端3’UTR(3’untranslated region)发生了不同程度的缺失,插入和重组突变。本研究开展了 2017-2022年间华东地区ALV-J分子流行病学调查,研究了gp85基因以及3’UTR变异对于病毒的复制效率,组织偏好性以及致病性等相关特征的影响。1 2017-2022年华东地区ALV-J分子流行病学为了解华东地区鸡群中ALV-J的感染情况,本研究对从2017-2022年间6个省疑似ALV-J感染的531份血液和临床样品进行病毒分离,亚型鉴定以及全基因测序。最终鉴定出131份ALV阳性样品,从中成功分离并且全基因测序了 31株病毒,包括ALV-A两株,ALV-B一株,ALV-K一株,ALV-J 27株。其中,27株ALV-J全基因长度为7431-7695bp,与ALV-J原型毒株HPRS103同源性为92.1%-93.5%。分离的ALV-J毒株gag基因与pol基因均相对保守,与HPRS103的同源性分别为94.2-95.3%和95.6-97.6%;27株中有22株在pol基因的C端有一个G到A的碱基突变,提前产生了 一个终止子,将Pol蛋白截短了 8个氨基酸。研究发现分离株间同源性为93.7%-99.2%。与原始毒株比较,env基因相似度为92.6%-96.1%,在进化树上可以分为三个大分支。变异遍及整个env,包括插入突变和缺失突变,尤其是藏鸡毒株TBC-J4以及TBC-J6在高变区hr2发生了显著的缺失突Tofacitinib抑制剂变。根据AlphaFold2预测的蛋白二级结构,不同毒株gp85蛋白形态结构较保守,均含有7-8个α-螺旋和9-11个β-折叠结构。66.7%(18/27)的ALV-J毒株在U3处出现11bp的缺失,导致这些毒株比以往毒株多了 2-3个转录因子结构域(motif),尤其是C/EBPalp结构域。3’UTR的序列分析结果显示,不同ALV-J在3’UTR处发生不同程度的突变,其中所有毒株均在r-TM处有缺失(70bp或170bp),而33.3%(9/27)的毒株缺失了 XSR,缺失与分离株的宿主遗传背景有一定关联。2 ALV-J gp85蛋白N糖基化修饰的鉴定和功能研究囊膜蛋白Env的gp85是ALV-J中变异最大的蛋白质,也是一种高度糖基化的蛋白质。糖基化修饰影响蛋白质折叠和蛋白特性,有助于蛋白质的结构稳定,对受体结合有重要作用。ALV-J序列分析发现不同毒株的gp85上均含有11-14个糖基化位点,相同遗传背景来源的ALV-J毒株,它们的N糖基化位点数量和位置相似。本研究通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术分析ALV-J毒株TBC-J6的gp85,结果显示有12个位点检测到含有N糖基化,并且这些位点主要由复杂型糖链构成。每一个N糖基化位点的平均糖链分子量在1438Da到2898Da之间,gp85的N糖基化糖链分子量约为25kD。对TBC-J6毒株的感染性克隆进行点突变以及病毒拯救分析,发现两个N糖基化位点N17和N193对于病毒培养滴度有显著影响。利用多重位点突变以及回补实验分析发现,N193位点是高变区hr2中影响ALV-J毒株滴度的关键位点;免疫共沉淀和受体封闭实验以及ELISA的结果证明,N193突变后能够导致Env蛋白与受体NHE1的亲和力降低。通过定量分析细胞上清中病毒蛋白表达量,发现N17的突变能影响病毒在上清中的含量。进一步研究显示N17影响Env蛋白切割,从而影响后续病毒的组装出芽。3 ALV-J 3’UTR的不同缺失突变对病毒复制的影响3’UTR在基因转录以及转录后调控中起着至关重要的作用,决定mRNA的命运,包括影响其表达转录,稳定性,在组织和亚细胞结构的分布等,从而调控蛋白质行使功能,最终调节生物的生命活动。本研究对5种突变型3’UTR在ALV-J毒株中的功能进行了分析,发现△r-TM类型3’UTR的ALV-J毒株占比最高(107/192),通过构建含有不同3’UTR的ALV-J毒株并接种细胞,证明不同3’UTR与病毒复制能力相关。含有△r-TM类型3’UTR的A寻找更多LV-J毒株在原代肝细胞CEL和血管内皮细胞chEC中生长最好。将ALV-J的gag-pol基因以及不同3’UTR插入到pcDNA3.1载体中以此构建ALV-J亚基因组质粒,并将它们转染细胞,利用q-RT-PCR检测mRNA的含量。结果显示所有形式的3’UTR均不影响ALV-J mRNA半衰期,且它们协助病毒全长mRNA核输出的能力也没有差异。然而,发现不同3’UTR对mRNA转录效率有明显影响,并具有一定的组织偏好性;不同3’UTR对外源基因表达有增强子作用。本研究以ALV-J的分子流行病学为基础,探索近期华东地区ALV-J病毒的流行状况和基因变异情况,结果发现囊膜蛋白gp85以及非编码区3’UTR是变异最大的两Single molecule biophysics个区域,这些变异导致病毒的生物学特性发生显著变化。首次利用液相色谱-质谱联用技术,结合点突变方法对ALV-J gp85的N糖基化进行了研究,并鉴定出两个关键位点N17和N193。探索了非编码区3’UTR对于病毒mRNA稳定性,出核以及转录的影响,结果显示3’UTR可作为增强子促进病毒基因的转录。这些结果为今后研究病毒复制以及潜在的抗病毒策略提供了新思路。